定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

要約

比色アッセイのスイートが急速に区別するタンパク質、RNA、DNA、および潜在的に異種生体試料中の再ducing糖に記載されている。

要約

生化学的な実験は、一般的に潜在的に異種の標本で正確な核酸の初期段階での知識、、、タンパク質、その他の生体分子のコンポーネントを必要とします。核酸は、それは容易に区別することはできませんが（ 例えば _、260）、蛍光（ 例えば 、蛍光色素の結合）、または比色（ヌクレオシド特有の発色の化学反応^）。1光度アール分析方法など、いくつかの確立されたアプローチを介して検出することができますそれは280 nm付近で主に吸収260nmおよびタンパク質近く主に吸収する核酸、の相対量の簡便かつ迅速な²アセスメントを提供しているので、DNAからRNAが_、260/280比は、一般的に採用されている。 1.5 ³比<純粋な核酸（NA）の比によって特徴付けられる一方0.8は、 "純粋な"タンパク質試料の指標として採用されています>。

ホーwever、タンパク質/ NAのコンテンツがあると明確に、または確実に単純なUV-VIS分光光度測定から推測できないようなシナリオがあります。いくつかの小さなRNA結合タンパク質の場合と同様、例えば、（i）のサンプルは、≈280 nmの（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）の吸収を担当する芳香族アミノ酸の相対的に欠いている1つ以上のタンパク質が含まれていたり、 （ⅱ）サンプルはタンパク質/ NA含有量ははるかに少ない明らかであり、さらにタンパク質とNAコンポーネント間のいくつかの高親和性の関連性を反映している可能性がある中間の₂₆₀ / A ₂₈₀比（〜0.8 <〜1.5）を、示すことができる。このようなシナリオのために、私たちは急速に生体分子の潜在的混合試料中のRNA、DNA、および還元糖を区別するための比色アッセイの本明細書中にスイートを記述します。方法はベネディクトの、Bial社の（オルシノール）、およびDischeの（ジフェニルアミン）試薬にペントースおよび他の炭水化物の感受性差に依存して、合理化されたプロトコルは、comできるコンポーネントを分離することのいずれかの追加手順なしで、ほんの数分で竣工。アッセイは、RNAとDNAの区別だけでなく、例えば、グルコース、フルクトース、リボース（ 図1）のようなフリーの還元糖の存在を示すために並行して行うことができる。

概要

多くの細胞生物学では、DNAとRNAが関与する分子間相互作用を介して行われます^。4これらの天然に存在する核酸（NAS）（ 例えば 、二価カチオンタンパク質^、6とし、in vivoでの小分子化合物とリガンドのホストと、互いに⁵対話^7）。相互作用は（動力学的に）短期または長命かもしれ範囲高から低親和性（熱力学的強度）に中等度の場合があり、また化学的性質や特異性の大幅な変動を示すことができます-いくつかの団体は、非常に特異的である（ 例えば 、DNA· ··転写因子は、RNA···スプライシング因子）、他の相互作用は、必ずしも、はるかに一般的な（ 例えば 、DNA···細菌のヒストン様蛋白質HU ^8）している間。 NASとの非特異的な相互作用はbiomoの混合物を含むin vitro実験のための実用的な結果をもたらす可能性があるlecules、それはいくつかのNASは、少なくとも使用されている実験条件のいくつかのサブセット（イオン強度、溶液のpH、 等 ）で、目的の生体分子に関連付けることが可能で、さらにそうであるように。

大腸菌細胞培養における組換えタンパク質の異種過剰発現を介して 、例えば、利息（ポイ）のタンパク質の産生を考慮して、そのような手順は、日常的に実質的に任意の構造生物学の研究室で行われる⁹さらなる実験のための準備では、そのような。生化学/生物物理学的特性、結晶化などのように、初期の取り組みは、一般的に理想的に化学的に均質と生物物理学的に単分散の標本として、できるだけ純粋な形としてPOIの十分な量を得ることに焦点を当てる。宿主細胞の破壊の後、代表的な浄化ワークフローの初期段階では、EからPOIを隔離することを目指して大腸菌タンパク質、核酸、細胞壁の破片、細胞溶解物のおよびその他のコンポーネント。ただし、ホストNASはいくつかの物理化学的な理由のためにポイと共精製することができる-非常に基本的なPOIが非特異プルダウン宿主DNA / RNAのかもしれません。POIは（ 例えば 、前述のHU）ジェネリックNA-結合活性を持つことができます。 POIは、宿主のRNAまたはDNAでかなり特定のNA-結合タンパク質が、展示物の交差反応性であってもよく、ホストNASはPOIにクロマトグラフィーマトリックスと相互作用し、それによって、単に共溶出ができるように続きます。 NAの不純物はおそらく下流の実験（ 例えば 、POI•RNA結合¹⁰の蛍光異方性アッセイ）を妨害する可能性がありますので、POIにホストNAの見境のない、高親和性結合は厄介な問題を提起することができます。このような相互作用は、POIの核酸結合能を照らす別の方法として、予期せぬPOIが···NAの関連付けも、偶発的に閲覧することができます。どちらにしても、NASはキーコンポーネントや汚染物質であるかどうか、片方が最初に定量化しなければなりません下流の実験の準備のために共同浄化NAのタイプ（DNA、RNA）を識別します。

いくつかの分析法の検出とサンプルでNASを定量するために存在しています。利用可能なメソッドのほとんどは、（基本的にはどちらか（ 例えば 、チアゾールオレンジまたはNAに他の蛍光色素の結合）蛍光（ 例えば _、260の吸光度値と₂₆₀ / A ₂₈₀比）分光光度、または比色アール化学反応へのヌクレオシドの感受性しかし、RNAまたはDNAのポリヌクレオチドの種類を識別するための重要なステップは、これらの定量の多くの範囲を超えて、電磁スペクトルの紫外-可視領域で吸収降伏発色団）が、、最近ドゥ·メイらによって記載され、図¹アプローチ。ここでは、急速にタンパク質性のサンプルにはNAコンポーネントの種類を識別するための比色アッセイのセットを提供します。

プロトコルは、ここでcを説明効率的に潜在的なNAの不純物を分離する追加のステップなしで実行され、糖質^11を減少させるため^のベネディクトのアッセイに依存し、2'-deoxypentosesのペントース^12,13及びジフェニルアミン反応^14,15（ 図1および図2）オルシノール検定さ。ベネディクトのテスト（ 図2a）は、アルドース糖の形として砂糖のカルボニルの付随酸化によるCu ₂ Oのカルボン酸部分と生産にCu ^{2 +を} 、減少させるために、線形、開鎖（アルデヒド）の能力を活用不溶性の赤色沈殿。この反応は、アルドースやケトースのようなフリーの還元糖（エンジオール中間体を介して対応するアルドースに変換する）とではなく、DNAまたはRNAポリヌクレオチドの共有バックボーンの一部として循環形式にロックされペントース糖と陽性になります。無料のヘミアセタール機能のミニマル要件、他の共有者のためしたがって、潜在的な妨害物として働く- -このアッセイで陽性でしたmpoundsは、α-ヒドロキシケトンおよび短いオリゴ糖（ 例えば二糖マルトース）が含まれています。両方Bial社のオルシノール（ 図2b）とDischeのジフェニルアミン（ 図2c）の反応は、ポリヌクレオチド鎖の最初の破壊に基づくものであり、ヌクレオシドの脱プリン反応、さらに酸または親ヌクレオチドの塩基触媒による加水分解を経て、フラン-2を得るためにカルボアルデヒド（ フルフラール ）誘導体;これらのデリバティブは、そのようなオルシノール（Bial社の）またはジフェニルアミン（Discheの）大部分は未知の化学構造の着色された縮合生成物を形成するための試薬 ​​としてフェノールどちらヒドロキシと反応する。 DischeのアッセイのRNA特異対DNAは五炭糖がさらにジフェニルアミンと反応して、ω-hydroxylevulinylアルデヒドに酸化されやすいようにするために、2'-脱酸素化でなければならないという事実から生じ酸性条件下で明るい青コンデンセート（ 図2c）を得た。ここで説明する合理化されたプロトコルを使用して、我々はこれらの糖特異的比色反応はRNAとDNAとを区別することができ、また、そのような生体分子試料中のグルコース、フルクトース、またはリボースなどのフリー還元糖の存在を示すことに気づいています。

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プロトコル

1。糖分を減らすためのベネディクトのアッセイ

1. 940 mMの無水炭酸ナトリウム、588 mMクエン酸ナトリウム水和物、68 mMの硫酸銅（II）五水和物 - ベネディクト試薬の適切な量を用意する。この試薬は、反応性に目立った変化が、少なくとも6ヶ月間室温（RT）で保存することができます。
2. 上記試薬は6倍です。このように、600μlの反応のために、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブ（ 例えば 、エッペンドルフブランド）にベネディクト試薬100μlを加える。
3. このチューブに10μlのサンプルを500μlのどこにでも追加します。最適なボリュームが初期試運転で発色の強度に基づいて決定することができる。十分なサンプルが利用可能であれば、その後のアッセイで希釈後、可能な最大サンプル·ボリューム（ すなわち 、全体的な反応容量6分の5、この場合のサンプルを500μl）でこのような試験を開始します。
4. TUに蒸留H ₂ Oを追加ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜて、600μlに最終的なボリュームをもたらすことである。
5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
6. 浴から加熱された試料を取り出して、それを室温で10分間放置してください。
7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG（FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm）でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
8. アリコートきれいにキュベットに注入し、このチューブから上清。
9. 水とUV-VIS分光光度計を空白にします。
10. 475 nmで、このサンプルの吸光度を測定します。

2。ペントース糖用Bial社のオルシノールアッセイ

1. 新鮮Bial社の試薬 ​​の適量準備- 24.2 mMのオルシノール水和物（この化合物の構造については 、 図2bを参照）、6 M塩酸、0.025％（w / v）の塩化第二鉄六水和物の点に注意してください。ストレージ容量を拡張できる、Bial社の試薬 ​​は、2つの別々の原液として調製することができる：（i）試薬[濃HClで0.05％（w / v）のFeCl3•6H ₂ O〕および（ii）試薬B [422 mMのオルシノール水和物は95で調製した％エタノール]。試薬6ヶ月間室温で保存できます。試薬Bは、光の露出を制限するための箔で覆って、1ヶ月間、4℃で保存することができます。これらの原液を15（）中で混合されています：使用前に1（b）はV / v比。
2. 上記試薬は2倍に拡張しています。したがって、1.0 mlの反応では、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブにBial社の試薬500μlを添加する。
3. このチューブに10μlのサンプルを500μlにどこでも入れる。十分なサンプルが利用可能である場合はノート1.3％（上記）と同様にして、可能な最大サンプル量を（ すなわち 、半分反応全体のボリューム、この場合のサンプルを500μl）を用いて試験反応を開始し、そこから薄める。
4. fを持って来るためにチューブに蒸留H ₂ Oを追加1.0ミリリットルにinal容積;ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜる。
5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
6. 浴から加熱された試料を取り出して、それを室温で10分間放置してください。
7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG（FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm）でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
8. アリコート目視検査のためのクリーンなキュベットに注入し、このチューブから上清。
9. 半定量分析のために、水とUV-VIS分光光度計をブランクおよび660nmでキュベット、サンプルの吸光度を測定する。

3。 2'-deoxypentose糖についてDischeのジフェニルアミンアッセイ

1. 60mMのジフェニルアミン、11M氷酢酸、179 mMの硫酸、62％v / vエタノール- Discheのジフェニルアミン試薬の適切な量を用意する。この試薬は、事前にすることができます事前に比べ、ダーク容器内に室温で保存、または光の露出を制限するために、箔で覆われている。実際には、それが反応性には明らかな変化と、2〜3ヶ月を準備することができますが、光感受性のために試薬が、無期限に保存するべきではありません。
2. 上記試薬は2倍に拡張しています。したがって、1.0 mlの反応では、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブにDischeの試薬500μlを添加する。
3. このチューブに10μlのサンプルを500μlにどこでも入れる。十分なサンプルが利用可能である場合はノート1.3％（上記）と同様にして、可能な最大サンプル量を（ すなわち 、半分反応全体のボリューム、この場合のサンプルを500μl）を用いて試験反応を開始し、そこから薄める。
4. 1.0mlに最終的なボリュームを持って来るためにチューブに蒸留H ₂ Oを追加します;ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜる。
5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
6. 浴から加熱された試料を取り出して、アロ室温で10分間冷却して、それをワット
7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG（FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm）でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
8. アリコート目視検査のためのクリーンなキュベットに注入し、このチューブから上清。
9. 半定量分析のために、水とUV-VIS分光光度計をブランクおよび600nmでキュベット、サンプルの吸光度を測定する。

4。さらに使用上の注意

1. 分子の以下のクラスは、各アッセイのために、正と負の制御反応に適した参照化合物である：
   • ベネディクトの-正=フリーリボース、フルクトース、グルコース、負=、RNA、DNA、ATP、 など 。 （任意の糖類が遊離還元糖の機能性を欠いている）
   • Bial社の-正= RNA（ 例えばパン酵母エキス）、リボースは、ATP、UMP、負=ウシSERUMアルブミン（BSA）、または任意の他のタンパク質
   • Discheの-正= DNA（ 例えばウシ胸腺）、負= RNA、ATP など 。 （任意の非2'-脱酸素ヌクレオチド）
2. これらのアッセイは、しばしばタンパク質精製で使用される化合物にかなり弾力的であることが判明している。例えば、NaClなど、（NH _4）2 SO _{4、K 2} SO ₄などの一般的な塩には干渉しなかったし、反応がで一般的に影響現れる希釈剤の内容。 pHは非常に基本的である場合、界面活性剤または尿素のようなカオトロピック剤は、アッセイの反応性に影響を与える可能性があり、酸性のpH範囲にニュートラル（テキストと陽子を見ているから、基礎となる反応化学の一般Bial社さんとDischeのアッセイのために最も最適である図2b、c）のインチ潜在的に次善の反応条件は、疑いのある干渉など 。正と負の制御実験wを使用して、ケース·バイ·ケースでテストする必要がありますi番目の基準化合物。

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結果

結果は、既知の基準化合物へのこれらの比色アッセイのアプリケーションについては、 図3に示されている。代表的な定性データは、ベネディクトの（a）は、Bial社のオルシノール（b）、およびDischeのジフェニルアミン（c）のアッセイのために示されており、これらの3つのアッセイのための標準曲線を図4に示します。パネル3（AC）で、左側のパネルは適切に反応/反...

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ディスカッション

比色アッセイは、急速にそのようなさらなる研究のための準備として、全細胞溶解物からのタンパク質、RNAまたは複合体を精製する際に遭遇するなどの生体分子の混合物の化学的性質を評価するためのシンプルなアプローチを提供するここに提示した。構造生物学は、このような試料の不均一性など、よりネイティブライクなアセンブリ、徐々に大きな課題を追求したように、複雑で多?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬や機器	サプライヤー/会社	カタログ番号	コメント、メモ
無水炭酸ナトリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	S263
クエン酸ナトリウム二水和物	シグマ	S-4641
硫酸銅（II）五水和物	VWR	VW3312-2
オルシノール一水和物	シグマアルドリッチ	O1875
濃HCl	VWR	BDH3030
塩化第二鉄六水和物	シグマ	F-2877
ジフェニルアミン	アルドリッチ	112763
氷酢酸	フィッシャー·サイエンティフィック	A28
硫酸	シグマアルドリッチ	258105
エタノール	Koptec	V1101
リボース	シグマ	R-7500	1パーセントはprep W / H 2 O中のV
パン酵母（S.セレビシエ ）からリボ核酸	シグマ	R6750	H 2 O中の10 mg / mlの準備; -20℃で保存
ウシ胸腺からデオキシリボ核酸（ナトリウム塩）、	シグマ	D1501	H 2 O中の10 mg / mlの準備、4℃で保存
			試薬、機器＆安全 材料は、foに記載されています彼らはProtocol]セクションに表示される順序でテーブルをllowing。それ以外の場合（上記の）断りのない限り、すべての試薬は周囲の室温や照明で保存することができる。 （ 例えば 、マイクロチューブ）の下に記載されていない項目については、通常のメーカー/モデル/さまざまな標準的な生化学実験室で見つかった（ 例えば 、エッペンドルフブランド1.5ミリリットルマイクロチューブ）を使用することができる。標準のプラスチック製のマイクロチューブを遠心分離（ 例えば 、各プロトコルの終わり近くに土砂粒子材料へ）を含む手順を使用する必要があります。特段の材料は、長いチューブを封止することができるので、望ましいん;生化学研究室で見られる典型的なポリプロピレン製のチューブがうまく機能します。安全上の懸念や廃棄物処理の面では、標準的な実験室の注意事項は、（安全メガネ、ヒュームフード）と協力し、濃酢酸、塩酸、または硫酸を含む溶液は廃棄する際は、事前にペアリングを払うべきである。などの有機試薬のオルシノールまたはDIPHenylamine、ニトリル手袋は、一般的なラテックス（天然ゴム）様々な好ましい。