Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Özet

Kolorimetrik tahlillerin paketi hızla ayırt edici protein, RNA, DNA, ve potansiyel olarak heterojen biyomoleküler örneklerinde yeniden ducing şekerler için açıklanmıştır.

Özet

Biyokimyasal deneyler genellikle potansiyel olarak heterojen örneklerde doğru nükleik asit erken bir aşamada bilgi,,, protein ve diğer biyomoleküler bileşenleri gerektirir. Nükleik asitler kolayca ayırt edemez rağmen (örneğin, A _260), florometrik (örneğin, floresan boya bağlayıcı), veya kolorimetrik (nükleozid özel kromojenik kimyasal reaksiyonlar). ¹ spektrofotometrik olarak analitik yöntemler de dahil olmak üzere birçok yerleşik yaklaşımları ile tespit edilebilir RNA DNA, A ₂₆₀ de 260 nm ve öncelikle 280 nm civarındaki emer protein yakınındaki ağırlıklı emer nükleik asit, göreli içeriğinin basit ve hızlı ² değerlendirme sunuyor / A ₂₈₀ oranı genellikle istihdam edilmektedir. 1.5 ³ Rasyolar <saf nükleik asit (NA) oranları ile karakterize iken 0,8, 'saf' protein örneklerinin göstergesi olarak alınır>.

HoWever, protein / NA içerik olarak açıkça veya güvenilir basit uv-vis spektrofotometrik ölçümler anlaşılan olamaz hangi senaryo vardır. Örneğin, (i) örnek olarak, bazı küçük RNA-bağlayıcı protein ile olduğu gibi, ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) de emilim için sorumlu aromatik amino asitler nispeten yoksun olan bir tane ya da daha fazla protein içerir, ve edebilir (ii) numuneleri protein / NA içeriği çok daha az açıktır ve hatta protein ve NA bileşenleri arasındaki bazı yüksek afinite dernek yansıtabilir ara A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranları (~ 0.8 <~ 1.5), sergileyebilmektedir. Bu tür senaryolar için, biz hızla RNA, DNA ve biyomoleküllerin potansiyel karışık örnek indirgen şekerler ayırt etmek için burada kolorimetrik testlerin bir paketi açıklamak. Yöntemler Benedict'in için pentozlara ve diğer karbonhidratların diferansiyel duyarlılığı güveniyor, Bial (orcinol) ve Dische nin (diphenylamine) reaktifler; aerodinamik protokolleri com olabilirmaddeleri ayırmak zorunda herhangi bir ek adıma gerek kalmadan, birkaç dakika içinde pleted. Deneyleri de, RNA ve DNA arasındaki farkı olarak, glikoz, früktoz, riboz ve (Şekil 1) gibi serbest indirgeyici şekerler arasında varlığını belirtir paralel olarak gerçekleştirilebilmektedir.

Giriş

Much hücre biyolojisi DNA ve RNA içeren moleküler etkileşimler aracılığıyla gerçekleşir. ⁴ Bunlar doğal olarak oluşan nükleik asitler (UA) (örneğin, iki değerlikli katyonlar proteinler, ⁶ ve in vivo küçük molekül bileşiklerinin ve ligandların bir ev sahibi ile, birbiri ile etkileşim ^{5 7).} Etkileşimler olabilir kısa veya (kinetik) uzun ömürlü, düşük afinitesi (termodinamik dayanım) orta yüksek değişebilir, hem de kimyasal özellikleri ve özgüllüğünü önemli çeşitlilik gösterebilmesidir - bazı dernekler (örneğin, DNA oldukça özeldir · · transkripsiyon faktörleri, RNA · · · yapıştırma faktörler), diğer etkileşimleri mutlaka çok daha genel ise (örneğin, DNA · · · bakteriyel histon benzeri HU proteinler ^8). UA ile Non-spesifik etkileşimler biomo karışımları içeren in vitro deneylerde pratik sonuçları olabilirlecules, bazı UA, en azından kullanılan deneysel koşullar gibi bir kısmını (iyonik kuvvet, çözeltinin pH, vs) altında, ilgi biyomolekülleri ile ilişkilendirir, mümkünse, ve hatta büyük bir olasılıktır.

Escherichia coli hücre kültüründe yeniden birleştirici proteinin heterolog aşırı ekspresyonu vasıtasıyla, örneğin, ilgi (PI) bir proteinin üretimi düşünün, bu tür bir prosedür rutin olarak hemen hemen herhangi bir yapısal biyolojide laboratuvar gerçekleştirilir ⁹ başka deneyler için hazırlanırken, bu gibi. / biyokimyasal karakterizasyonu biyofiziksel, kristalizasyon, vb., ilk çabalar genellikle ideal olarak, kimyasal olarak homojen ve biyofiziksel monodisperse örnek olarak, mümkün olduğunca saf bir formda olarak da POI yeterli bir miktar elde edilmesi ile ilgili odak gibi. Konak hücre bozulması sonra, tipik bir arıtma akışı erken evrelerinde E. POI izole etmek için amaç coli proteinler, nükleik asitler, hücre duvarı enkaz,ve hücre lizat diğer bileşenler. Ancak konak UA'lar birçok fizikokimyasal nedenlerle POI ile birlikte arındırmak olabilir - çok temel bir İÇN non-spesifik olarak açılan konak DNA / RNA olabilir; POI (örneğin, yukarıda belirtilen HU) genel NA-bağlanma aktivitesi olabilir; POI konak RNA veya DNA ile oldukça spesifik NA-bağlayıcı protein ancak sergi çapraz reaktivite olabilir; böylece ve; ana UA'lar bir kromatografi matris ile etkileşim ve böylece sadece co-elute POI olabilir. NA safsızlıklar olasılıkla mansap deneyler (örneğin, POI • RNA bağlayıcı ¹⁰ floresans anizotropi testleri) ile müdahale edecek, çünkü bir İÇN'ye konak UA'lar ayrım gözetmeksizin, yüksek afiniteli bir can sıkıcı sorun teşkil edebilir. Bu tür etkileşimlerin POI nükleik asit bağlama kapasitesi aydınlatmak Alternatif olarak, beklenmeyen POI · · · NA dernekleri de, tesadüfen görülebilir. Her iki şekilde de, UA'lar anahtar bileşenleri veya kirletici olup olmadığını, bir ilk ölçmek gerekir veakış deneyler için hazırlık içinde eş-arındırıcı NAS tipi (DNA, RNA) tanımlar.

Çeşitli analitik yöntemler tespit ve bir örnek UA'lar miktarlarının yapılmamış. Mevcut yöntemlerin çoğu (temelde ya (örneğin, tiazol portakal veya NA diğer floresan boya bağlayıcı) florometrik, (örneğin, A ₂₆₀ absorbans değerleri ve A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranları) spektrofotometrik veya kolorimetrik olarak kimyasal reaksiyonlara nükleosidlerin duyarlılık elektromanyetik spektrumun UV-vis bölge) emici verim kromofor olarak son zamanlarda De Mey ve ark tarif. ¹ Ancak, RNA veya DNA gibi polinükleotid türünü tanımlamanın önemli adım bu kantitatif çoğunun kapsamı dışındadır yaklaşımlar. Burada hızlı bir protein örnek NA bileşenlerin türleri belirlemek için kolorimetrik analizler kümesi sağlar.

Protokoller burada c açıklananverimli bir potansiyel NA safsızlıkların izole ek adımlar yürütülür, ve (Şekiller 1 ve 2) 2'-deoxypentoses arasında şekerler ^{11, 12,13} pentozlara için orcinol tahlil, difenilamin ve reaksiyon ^14,15 azaltılması için Benedict'in tahlil dayanmak edilmesi . Benedict'in testi (Şekil 2a) ^+, şeker en karbonil birlikte oksidasyon ile olduğu gibi Cu ₂ O-, bir karboksilat parçası ve üretim için Cu ² azaltmak için bir aldoz şeker doğrusal, açık-zincirli (aldehit) formu yeteneği kullanır çözünmeyen kırmızı çökelti. Bu reaksiyon gibi aldoses ve ketoses (hangi enediol ara ile ilgili aldoses dönüştürmek) gibi ücretsiz indirgen şekerler ile pozitif test değil, bir DNA veya RNA polinükleotid arasında kovalent omurga parçası olarak siklik forma kilitli olduğundan pentoz şeker ile. Olacak Bir serbest hemiasetal işlevsellik minimalist gereksinimi, diğer ortak nedeniyleve bu nedenle potansiyel interferents olarak hareket - - Bu testte pozitif test edebilir mpounds α-hidroksi-ketonlar ve kısa oligosakkaritler (örn. disakkarit maltoz) içerir. Her iki Bial orcinol (Şekil 2b) ve Dische en difenilamin (Şekil 2c) reaksiyon polinükleotid omurga başlangıç ​​imha dayanır, nükleosid depurination ve daha fazla asit ya da ebeveyn nükleotidlerin baz-katalizörlü hidroliz yolu ile, furan-2 vermek üzere -karbaldehid (furfural) türevleri, bu türevleri daha sonra bu orcinol (Bial) ya da difenilamin (Dische) 'ın tam olarak bilinmemektedir kimyasal yapısının renkli yoğunlaşma ürünleri oluşturmak için reaktifler olarak fenol ya da bir polihidroksi ile reaksiyona girer. Dische en tahlil RNA özgüllüğü karşı DNA pentoz şeker daha diphenylamine ile reaksiyona ω-hydroxylevulinyl aldehit, oksidasyon duyarlı olmak amacıyla 2'-deoksijenlenmedeki olmalıdır gerçeğinden kaynaklanmaktadırasidik koşullar altında bir parlak mavi bir yoğuşma (Şekil 2c) elde edildi. Burada tarif edilen aerodinamik protokolleri kullanılarak bu şeker özgü kolorimetrik reaksiyon, RNA ve DNA arasındaki farkı olabilir ve ayrıca bu tür bir biyomoleküler örnek olarak glikoz, früktoz, riboz ya da serbest gibi indirgeyici şekerler varlığını gösterir olduğunu bulduk.

Protokol

1. Şekerler Azaltılması Benedict Testi

1. 940 mM susuz sodyum karbonat, 588 mM sodyum sitrat dihidrat, 68 mM bakır (II) sülfat pentahidrat - Benedict'in reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif tepkime içinde değişiklik fark ile, en az altı ay boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
2. Yukarıdaki reaktif 6x olduğunu. Örnek test edilecek başına Böylece, 600 ul reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü (örn., Eppendorf marka) ile Benedict'in reaktif 100 ul ilave edin.
3. 10 ul bu tüpüne örnek 500 ul yere ekleyin; optimum ses bir ilk deneme vadede renk oluşumu yoğunluğuna göre tespit edilebilir. Yeterli numune mevcut ise, daha sonraki deneylerde daha sonra seyreltik maksimum olası örnek hacmi (yani, toplam reaksiyon hacmi beş-sixths, bu durumda, örnek 500 ul) bu tür denemeler başlar, ve.
4. Tu için GKD ₂ O ekleyinvorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak; 600 ul son hacim getirmek olacak.
5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
6. Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
8. Temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
9. Su ile uv-vis spektrofotometre Boşluk.
10. 475 nm'de Bu örnek absorbansları ölçülür.

2. Pentoz şekerler için Bial Orcinol Assay

1. . Taze Bial reaktif uygun bir miktar hazırlayın - 24.2 mM orcinol monohidrat (bu bileşiğin yapısı için bakınız Şekil 2b), 6 M HCl ile% 0.025 w / v demir klorür hekzahidrat Not:Uzun süreli depolama için, Bial reaktif iki ayrı stok solüsyonlar olarak hazırlanabilir: (i) Reaktif A [konsantre HCI içinde% 0.05 w / v FeCl3 • 6H ₂ O] ve (ii) Reaktif B [422 mM orcinol monohidrat 95'de hazırlanmış % etanol]. Reaktif A altı ay için RT saklanabilir; Reaktif B ışığa maruz kalma sınırı folyo ile kaplı, bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Kullanımdan önce 1 (B) v / v oranı: Bu stok çözeltinin 15 (A) 'da karıştırılır.
2. Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Bial reaktif 500 ul ilave edin.
3. Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin.
4. F getirmek için tüp GKD ₂ O ekleyin1.0 ml inal hacim; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak.
5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
6. Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
8. Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
9. Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 660 nm küvetini numune absorbansı ölçülür.

3. 2'-deoxypentose Şekerler için Dische en Difenilamin Assay

1. 60 mM difenilamin, 11 M glasiyal asetik asit, 179 mM sülfürik asit, v / v ethanol 62 -% Dische en difenilamin reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif önceden edilebilirönceden pared ve karanlık bir kap içinde oda sıcaklığında saklanabilir veya ışığa maruz kalma sınırı, folyo ile kaplanmıştır. Pratikte reaktivitede görünen hiçbir değişiklik ile her iki-üç ayda hazırlanabilir olsa ışık hassasiyeti nedeniyle reaktif, süresiz muhafaza edilmemelidir.
2. Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Dische reaktifi 500 ul ilave edin.
3. Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin.
4. 1.0 ml son hacim getirmek için tüp GKD ₂ O ekleyin; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak.
5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
6. Banyo ve allo gelen ısıtmalı örnek kaldır10 dk için oda sıcaklığında soğumasına o w.
7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
8. Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
9. Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 600 nm küvetini numune absorbansı ölçülür.

4. Diğer Kullanım Notları

1. Moleküllerin aşağıdaki sınıflar her bir deney için pozitif ve negatif kontrol reaksiyonları için uygun referans bileşikler şunlardır:
   • Benedict'in - Olumlu = ücretsiz riboz, fruktoz, glikoz; Negatif = RNA, DNA, ATP, vb. (Ücretsiz bir indirgen şeker işlevselliği olmayan herhangi bir sakarit)
   • Bial - Olumlu = RNA (örneğin ekmek mayası ekstresi), riboz, ATP, UMP; Negatif = sığır serum albümin (BSA), ya da başka herhangi bir protein
   • Dische sitesi - Olumlu = DNA (örn. calf thymus); Negatif = RNA, ATP, vb. (Herhangi bir non-2'-deoksijenlenmedeki nükleotid)
2. Örneğin NaCl, _{(NH4) 2} SO ₄ ve K, ₂ SO ₄ müdahale etmediği gibi, örneğin genel tuzları, ve reaksiyon tarafından etkilenmez görünür; bu ölçümlerin daha çok protein saflaştırma kullanılan bileşikler için oldukça esnek olduğu tespit edilmiştir seyreltici içeriği. PH yüksek derecede bazik ise Deterjanlar veya üre gibi kaotropik ajanlar testlerinin reaktivite etkileyebilir, bir asidik pH aralığında nötr (metin ve protonlar görmek çünkü temel reaksiyon kimyası genellikle Bial ve Dische en deneyleri için en uygunudur Şekil 2b, c). Potansiyel olarak optimal reaksiyon koşulları, şüpheli interferents, vb. pozitif ve negatif kontrol deneyleri w kullanarak, bir vaka tarafından ayrı ayrı test edilmelidiri'inci referans bileşikleri.

Sonuçlar

Sonuçlar bilinen referans bileşikleri için bu kolorimetrik tahlillerin uygulama için Şekil 3'te de gösterilmiştir. Örnek nitel veri Benedict'in (a), Bial orcinol, (b) ve en Dische difenilamin (c) deneyleri için gösterilmiştir, ve bu üç deneyleri için standart eğriler Şekil 4 'de gösterilmiştir. Panelleri 3 (ac) 'de, sol paneller uygun bir reaktif / reaktif analit ile pozitif / negatif kontrol deneyleri göstermiştir; Protocols 1-3 (yukarıda) tarif edi...

Tartışmalar

Kolorimetrik testler hızla gibi daha ileri çalışmalar için hazırlık olarak proteinler, RNA veya tüm hücre lizat gelen kompleksleri arındırıcı karşılaşılan gibi biyomoleküler karışımlar, kimyasal yapısını değerlendirmek için basit bir yaklaşım sunmak Burada sunulan. Yapısal biyoloji gibi örnek heterojenlik gibi daha anadili gibi montajları, giderek büyük sorunlar, izlediği gibi, karmaşık ve çok bileşenli kompleksler oluşturduğu edilecektir. Supramoleküler meclisleri genellik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif veya ekipman	Tedarikçi / şirket	Katalog numarası	Yorumlar, notlar
Susuz sodyum karbonat	Fisher Scientific	S263
Sodyum sitrat dihidrat	Sigma	S-4641
Bakır (II) sülfat pentahidrat	VWR	VW3312-2
Orcinol monohidrat	Sigma-Aldrich	O1875
Konsantre HCI	VWR	BDH3030
Demir klorür hekzahidrat	Sigma	F-2877
Difenilamin	Aldrich	112763
Asetik sirke asidi	Fisher Scientific	A28
Sülfürik asit	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Riboz	Sigma	R-7500	% 1 hazırlık w / H 2 O v
Ekmek mayası gelen Ribonükleik asit (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	H2O içinde 10 mg / ml 'de prep, -20 ° C de saklamak
Calf thymus gelen deoksiribonükleik asit (sodyum tuzu),	Sigma	D1501	H2O içinde 10 mg / ml 'de prep, 4 ° C de saklamak
			Reaktifler, Ekipmanları ve Güvenlik Malzeme fo listelenenOnlar Protokol bölümünde göründükleri sırayla tabloya llowing. Aksi takdirde (yukarıda) Aksi belirtilmedikçe, tüm reaktifler oda sıcaklığı ve aydınlatma saklanabilir. (Örneğin, mikrosantrifüj tüpleri) Aşağıda listelenen herhangi bir ürün için, her zamanki marka / model / çeşitli standart biyokimyasal laboratuvar bulunan (örn., Eppendorf marka 1.5 ml mikrofuge'de tüpler) kullanılabilir. Standart plastik mikrofüj tüpler santrifüjleme (örneğin, her bir protokol sonuna yakın tortu parçacıklı malzeme için) içeren adımlar için kullanılmalıdır. Tüpler kapalı olabilir sürece hiçbir özel malzeme, tercih edilir; biyokimya laboratuvarlarında bulunan tipik polipropilen tüpler iyi çalışır. Güvenlik kaygıları ve atık bertarafı konusunda, standart laboratuar önlemler (koruyucu gözlük, duman davlumbaz) ile birlikte çalışarak ve konsantre asetik, hidroklorik veya sülfirik asit içeren solüsyonları imha öncesi soyma olunmalıdır. Gibi organik reaktifler için orcinol veya diphenylamine, nitril eldiven ortak lateks (doğal kauçuk) çeşitli tercih edilir.