신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

요약

colorimetric assays의 스위트 룸은 급속하게 구별 단백질, RNA, DNA, 그리고 잠재적으로 이기종 biomolecular 샘플에 다시 ducing 설탕에 설명되어 있습니다.

초록

생화학 실험은 일반적으로 잠재적 이기종 표본에 정확한 핵산의 초기 단계에서 지식,,, 단백질 및 기타 biomolecular 구성 요소가 필요합니다. 핵산이가 쉽게 구별 할 수 있지만 (예를 들어, _260), fluorometric (예, 형광 염료의 결합) 또는 colorimetric (뉴 클레오 사이드 별 chromogenic 화학 반응) ^1. 분광 아르 분석 방법 등 여러 설립 방식을 통해 감지 할 수 있습니다 RNA DNA에서 _260은 260 nm의 주로 280 nm의 가까이에 흡수 단백질, 근처에 주로 흡수 핵산의 상대적 내용의 간단하고 ^빠른이 평가를 제공으로 / A _280의 비율이 일반적으로 사용된다. 1.5 ^세 비율은 <순수 핵산 (NA)이 비율을 특징으로하는 동안 0.8는 '순수'단백질 표본을 나타내는로 이동합니다>.

호wever, 단백질 / NA 내용으로 명확하게하거나 안정적으로 간단한 UV-VIS 분광 측정에서 유추 할 수 없습니다있는 경우도 있습니다. 예를 들어,은 (i) 샘플 같은 일부 작은 RNA 결합 단백질의 경우는, ≈ 280 nm의 (TRP, 티르, Phe)에서 흡수에 책임이있는 향기로운 아미노산이 상대적으로 결여있는 하나 이상의 단백질을 포함하고 있습니다 (II) 샘플은 단백질 / NA 내용이 훨씬 덜 분명하다, 심지어 단백질과 NA 구성 요소 사이의 높은 친화력 협회가 반영 될 수 있습니다 중간 ₂₆₀ / A ₂₈₀ 비율을 (~ 0.8 <~ 1.5), 전시 할 수 있습니다. 이러한 시나리오의 경우, 우리는 빠르게 RNA, DNA, 그리고 분자의 잠재적 혼합 샘플에 설탕을 줄여을 구분하기 위해 본 colorimetric assays의 스위트 룸을 설명합니다. 방법은 베네딕트의에 pentoses 및 기타 탄수화물의 차동 감도에 의존 Bial의 (orcinol) 및 Dische의 (다이 페닐 아민) 시약은, 간소화 된 프로토콜은 COM 될 수 있습니다구성 요소를 분리해야하는 추가 단계없이 몇 분 만에 pleted. assays는뿐만 아니라 RNA와 DNA 사이의 구분과 같은 포도당, 과당, 그리고 리보오스 (그림 1)과 같은 무료 줄이고 설탕의 존재를 나타 내기 위해 병렬로 수행 할 수 있습니다.

서문

많은 세포 생물학은 DNA와 RNA를 포함하는 분자의 상호 작용을 통해 발생합니다. ^4이 자연적으로 발생하는 핵산은 (NAS) (예를 들어, 이가의 양이온 단백질, ⁶ 및 생체 내 작은 분자 화합물 및 리간드의 호스트와 함께 서로 ⁵ 상호 작용 ^7). 상호 작용이있을 수 있습니다 단기 또는 (kinetically) 수명이 긴, 낮은 친화력 (열역학적 힘)에 검토하기 위해 높은 곳에서 다양 할 수 있으며, 또한 화학 특성과 특이성에 상당한 변화를 전시 할 수 있습니다 - 일부 단체 (예, DNA 매우 구체적 · · · 전사 인자, RNA · · · 접합 요소), 다른 상호 작용 반드시 훨씬 더 일반적인하는 동안 (예를 들어, DNA · · · 세균 히스톤 같은 HU 단백질 ^8). NAS와 비 특정 상호 작용은 biomo의 혼합물을 포함하는 체외 실험에서에 대한 실질적인 결과를 가질 수lecules, 그건 일부 NAS가 적어도 사용되는 실험 조건의 일부 하위 집합 (이온 강도, 솔루션 산도 등)에 따라, 관심있는 분자와 연관 될 가능, 심지어 가능성이 있습니다.

대장균의 세포 배양에서 재조합 단백질의 heterologous 이상의 표현을 통해, 예를 들어, 관심 (POI)의 단백질의 생산을 고려, 이러한 절차는 정기적으로 거의 모든 구조 생물학 실험실에서 수행되는 ^구를 추가로 실험을 준비, 이러한. 생화학 / biophysical 특성, 결정 등., 초기 노력은 일반적으로 이상적인 화학적으로 균질하고 biophysically monodisperse 표본으로, 가능한 형태로 순수의 관심 장소의 충분한 수량을 확보에 주력으로. 호스트 세포의 파괴 후, 전형적인 정화 워크 플로우의 초기 단계 E.에서 관심 장소를 분리하는 것을 목표로 대장균의 단백질, 핵산, 세포 벽 파편,그리고 세포 lysate의 다른 구성 요소. 그러나, 호스트 NAS는 여러 물리 이유로 관심 장소로 공동 정화 할 수 있습니다 - 매우 기본적인 관심 장소가 아닌 특별히 풀다운 호스트 DNA / RNA 수 있으며, POI (예, 상기 HU) 일반 NA 바인딩 활동을 할 수 있습니다; POI는 호스트 RNAs 또는 DNAs있는 매우 특정 NA 결합 단백질 만 전시 교차 반응성 될 수 있으며,이 등등을하고, 호스트 NAS는 크로마토 그래피 행렬과 상호 작용함으로써 단순히 공동 elute 관심 장소로 할 수 있습니다. NA 불순물 가능성이 하류 실험 (예를 들어, POI • RNA 결합 ^(10)의 형광 이방성 assays)을 방해하기 때문에 관심 장소로 호스트 NAS의 무차별, 고친 화성 바인딩 애 태우게하는 문제를 야기 할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 POI의 핵산 결합 용량을 조명으로 또는 예기치 못한 POI는 · · · NA 협회는 또한 우연히 볼 수 있습니다. 어떤 방법을 사용하든, NAS 키 구성 요소 나 오염 물질이 있는지, 하나는 먼저 정량화해야합니다하류 실험에 대비 공동 정화 NAS의 유형을 (DNA, RNA) 확인합니다.

몇 가지 분석 방법은 감지하고 샘플에 NAS를 quantitating 존재합니다. 사용할 수있는 방법의 대부분은 (기본적으로 하나 (예를 들어, thiazole 오렌지 또는 NA에 다른 형광 염료의 결합) fluorometric (예를 들면, A ₂₆₀ 흡광도 값과 ₂₆₀ / A ₂₈₀ 비율) 분광, 또는 colorimetric 아르 화학 반응에 nucleosides의 민감도 전자기 스펙트럼의 UV-VIS 지역)에 흡수 항복 chromophores는 등 최근 드 현금 외 의해 설명되는 ^{1. 그러나,} RNA 또는 DNA로 폴리 뉴클레오타이드의 유형을 식별하는 중요한 단계는 다음과 quantitation의 많은의 범위를 벗어납니다 접근. 여기 빠르게 proteinaceous 샘플에서 NA 구성 요소의 유형을 식별하는 colorimetric assays의 집합을 제공합니다.

프로토콜은 여기 C를 설명이 효율적으로 잠재적 인 NA의 불순물을 분리의 추가 단계없이 실행, 그리고 (그림 1과 2) 2'-deoxypentoses의 설탕 ^11, pentoses ^12,13의 orcinol 분석, 그리고 다이 페닐 아민 반응 ^14,15을 줄이기위한 베네딕트의 분석에 의존 할 수 . 베네딕트의 시험 (그림 2A)는 ^+, 설탕의 카르 보닐의 수반하는 산화와 같은 잘라 내기 ₂ O의 카르 복실 잔기 및 생산에 잘라 내기 ² 감소 aldose 설탕의 선형, 오픈 체인 (알데히드) 폼의 능력을 활용 불용성 침전물 붉은 색. 이 반응은 aldoses 및 ketoses (이 enediol 중간체를 통해 해당 aldoses으로 변환) 무료로 감소 설탕 이랑 긍정적 인 테스트하지만, DNA 또는 RNA의 폴리 뉴클레오타이드의 공유 결합 백본의 일환으로 고리 형태로 고정되는 펜토 오스 설탕과. 것 무료 hemiacetal 기능의 최소한의 요구 사항, 다른 공동 때문따라서 잠재적 interferents의 역할 - -이 분석에 긍정적 인 테스트 할 수 mpounds은 α-히드 록시-ketones과 짧은 oligosaccharides (예를 들면 이당류의 말토오스)가 포함되어 있습니다. 두 Bial의 orcinol (그림 2B)와 Dische의 다이 페닐 아민 (그림 2C) 반응이 폴리 뉴클레오타이드 백본 초기 파괴에 의해 결정이되고, 뉴 클레오 사이드의 depurination 및 추가 산 또는 모 (母) 세포핵의베이스 촉매 가수 분해를 통해, 퓨란-2를 얻을 수 있도록 - carbaldehyde (푸르 푸랄 수치) 파생 상품, 이러한 파생 그런 다음 orcinol (Bial의) 또는 다이 페닐 아민 (Dische의) 대부분 알 수없는 화학 구조의 색 응축 제품을 구성하는 시약 등의 페놀 중 polyhydroxy으로 반응한다. Dische의 분석의 RNA의 특이성 대 DNA는 펜토 오스 설탕이 더 다이 페닐 아민과 반응 ω-hydroxylevulinyl 알데히드로 산화에 민감되기 위해 2'-deoxygenated해야하기 때문산성 조건 하에서 밝은 푸른 색 응축수 (그림 2C)를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명 된 간소화 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 이러한 설탕 특정 colorimetric 반응이 RNA와 DNA 구별 할 수 있으며, 또한 biomolecular 샘플에서 포도당, 과당, 또는 리보오스 무료로 감소 당분의 존재를 나타낼 것으로 나타났습니다.

프로토콜

1. 슈 거즈를 감소시키기위한 베네딕트의 분석

1. 940 MM 무수 탄산 소다, 588 MM 나트륨 구연산의 탈수, 68 MM 구리 (II) 황산염의 pentahydrate - 베네딕트의 시약의 적절한 수량을 준비합니다. 이 시약은 반응성에 더 눈에 띄는 변화 6 개월 이상 실온 (RT)에 저장할 수 있습니다.
2. 위의 시약은 6x입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 600 μl 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (예를 들어, Eppendorf 브랜드)에 베네딕트의 시약 100 μl를 추가합니다.
3. 10 μl에서 튜브에 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가, 최적의 볼륨이 초기 시운전에 색 형성의 강도에 따라 결정될 수있다. 충분한 샘플을 사용할 수 있다면 다음 assays에 희석 한 후 최대 가능한 샘플 볼륨 (즉, 전체 반응 양의 다섯 6 이죠,이 경우 샘플 500 μl)에서 이러한 실험을 시작합니다.
4. 부엉에 ddH ₂ O를 추가합니다vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 혼합 600 μl에 최종 볼륨을 가지고하는 것입니다.
5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
6. 목욕탕에서 온수 샘플을 제거하고 10 분 동안 RT에서 냉각 할 수 있습니다.
7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
8. 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
9. 물과 UV-VIS 분광 광도계를 빈.
10. 475 nm의에서이 샘플의 흡광도를 측정합니다.

2. 펜토 오스 슈 거즈에 Bial의 Orcinol 분석

1. . 신선한 Bial의 시약의 적절한 수량 준비 - 24.2 MM orcinol 수화물 (이 화합물의 구조에 대한 그림 2B 참조), 6 M HCL, 0.025 % w / V 철 염화물 hexahydrate 참고 :확장 스토리지를 들어, Bial의 시약은 두 개의 별도의 가공 솔루션으로 준비 할 수 있습니다 :은 (i) 시약 [집중 HCL에 0.05 % w / v를 FeCl3 • 6H ₂ O] 및 (ii) 시약 B [422 MM orcinol 수화물은 95에서 준비 %의 에탄올]. 시약는 6 개월 동안 RT에서 저장 될 수있다; 시약 B는 빛 노출을 제한 할 호일로 덮어 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에 1 (B) 브이 / v 비율 :이 주식 솔루션은 15 (A)에 혼합되어 있습니다.
2. 위의 시약은 2 배입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 1.0 ML 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 Bial의 시약 500 μl를 추가합니다.
3. 이 튜브에 10 μl의 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가 할 수 있습니다. 충분한 샘플을 사용할 수있는 경우 1.3에 따라 (위), 후 최대 가능한 샘플 볼륨을 (즉, 한 반 전체 반응 볼륨,이 경우 샘플 500 μl)를 사용하여 시험 반응을 시작하고 거기에서 희석.
4. F를 가지고 관에 ddH ₂ O를 추가합니다1.0 ML에 inal 볼륨, vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
6. 목욕탕에서 온수 샘플을 제거하고 10 분 동안 RT에서 냉각 할 수 있습니다.
7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
8. 육안 검사를위한 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
9. 반 정량 분석​​을 위해, 빈 UV-VIS 분광 광도계 물과 660 nm의에서 큐벳 샘플의 흡광도를 측정합니다.

3. 2'-deoxypentose 슈 거즈를위한 Dische의 다이 페닐 아민 분석

1. 60 MM 다이 페닐 아민, 11 M 빙하 아세트산, 179 MM 황산 산, V / V 에탄올 62% - Dische의 다이 페닐 아민 시약의 적절한 수량을 준비합니다. 이 시약은 미리 할 수​​ 있습니다사전에 앞에 서와 어두운 용기에 RT에 저장하거나, 빛 노출을 제한하는, 포일가 있었다. 실제로는 반응성에 아무 변화 엔 두 3 개월 준비 할 수 있지만 빛 감도로 인해 시약은 무기한으로 저장하지 말아야합니다.
2. 위의 시약은 2 배입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 1.0 ML 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 Dische의 시약 500 μl를 추가합니다.
3. 이 튜브에 10 μl의 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가 할 수 있습니다. 충분한 샘플을 사용할 수있는 경우 1.3에 따라 (위), 후 최대 가능한 샘플 볼륨을 (즉, 한 반 전체 반응 볼륨,이 경우 샘플 500 μl)를 사용하여 시험 반응을 시작하고 거기에서 희석.
4. 1.0 ML에 최종 볼륨을 가지고 관에 ddH ₂ O를 추가, vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
6. 욕조와여에서 온수 샘플을 제거10 분 동안 RT에서 냉각을 w
7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
8. 육안 검사를위한 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
9. 반 정량 분석​​을 위해, 빈 UV-VIS 분광 광도계 물과 600 nm의에서 큐벳 샘플의 흡광도를 측정합니다.

4. 또한 사용 정보

1. 분자의 다음 수업은 각 시험에 대한 긍정적이고 부정적인 제어 반응에 적합한 참조 화합물은 다음과 같습니다
   • 베네딕트의 - 긍정적 = 무료 리보오스, 과당, 포도당, 부정적 = RNA, DNA, ATP 등. (무료 줄이고 설탕 기능을 부족한 어떤 saccharide)
   • Bial의 - 긍정적 = RNA (예 : 베이커의 효모 추출물), 리보오스, ATP, UMP, 음성 = 소 경음 ... 알부민 (BSA) 또는 다른 단백질
   • Dische의 - 긍정적 = DNA (예 : 송아지 thymus), 음성 = RNA, ATP 등. (비 2'-deoxygenated 염기)
2. 이러한 NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, K ₂ SO ₄ 간섭하지 않았어요과 같은 예를 들어, 일반적인 소금, 그리고 반응에 의해 일반적으로 영향을받지 표시되며, 이러한 assays는 종종 단백질 정제에 사용되는 화합물에 매우 탄력적 인 것으로 밝혀졌다 희석제의 내용. 산도가 높은 기본적인 경우 세제 나 요소와 같은 chaotropic 에이전트는 assays의 반응성에 영향을 미칠 수 있으며,이 산성 pH의 범위 중간 (텍스트와 양자를 볼 수 있기 때문에 기본 반응 화학 일반적으로 Bial의와 Dische의 assays에 가장 적합합니다 그림 2B, C)에 있습니다. 잠재적 차선 반응 조건, 의심 interferents 등. 긍정적이든 부정적 제어 실험 w를 사용하여 사안별로 테스트해야i 번째 참조 화합물.

결과

결과는 알려진 참조 화합물에 이러한 colorimetric assays의 응용 프로그램에 대한 그림 3에 표시됩니다. 대표 질적 데이터는 베네딕트의 (A), Bial의 orcinol (B), 그리고 Dische의 다이 페닐 아민 (C) assays에 표시되며,이 세 assays에 대한 표준 곡선은 그림 4에 표시됩니다. 패널 3 (AC)에서, 왼쪽 패널은 적절히 반응 / unreactive analytes를 사용하여 부정적인 / 긍정적 인 제어 실험을 표시, 프?...

토론

colorimetric assays는 빠른 속도 등 자세한 연구를위한 준비 단백질, RNAs 또는 전체 셀 lysate에서 복합체를 정화 할 때 발생하는 등 biomolecular 혼합물의 화학 특성을 평가하기 위해 간단한 방법을 제공합니다 여기에 제시했다. 구조 생물학 이러한 샘플 이질성으로 더 네이티브처럼 어셈블리, 점진적으로 더 큰 도전을 추구으로 복잡하고 다중 구성 요소 단지로 인한 것입니다. Supramolecular 어셈블리 주...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약이나 장비	공급 업체 / 회사	카탈로그 번호	코멘트, 메모
무수 탄산 소다	피셔 과학	S263
나트륨 시트르산 이수화	시그마	S-4641
구리 (II) 황산염의 pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol 수화물	시그마 - 알드리치	O1875
집중 HCL	VWR	BDH3030
철 염화물 hexahydrate	시그마	F-2877
다이 페닐 아민	올드리치	112763
빙하 아세트산	피셔 과학	대답 28
황산	시그마 - 알드리치	258105
에탄올	Koptec	V1101
리보오스	시그마	R-7500	1퍼센트에서 사립 w / H 2 O의 V
베이커의 효모에서 Ribonucleic 산성 (S. cerevisiae)	시그마	R6750	H 2 O의 10 MG / ML에서 시험을 치루, -20 ° C에서 저장
송아지 thymus에서 데 옥시 리보 핵산 (나트륨 소금),	시그마	D1501	H 2 O의 10 MG / ML에서 시험을 치루, 4 ° C에서 저장
			시약, 장비 및 안전 재료는 강한에 나열되어 있습니다그들은 프로토콜 섹션에 표시되는 순서대로 테이블을 llowing. 기타 (위) 언급하지 않는 한, 모든 시약은 주변 실내 온도 및 조명에 저장할 수 있습니다. (예를 들어, microcentrifuge 튜브) 아래에 나열되어 있지 항목은 일반적인 제조사 / 모델 / 다양한 표준 생화학 실험실에서 발견이 (예를 들어, Eppendorf 브랜드 1.5 ML microfuge 튜브) 사용할 수 있습니다. 표준 플라스틱 microfuge 튜브는 원심 분리 (예를 들면, 각 프로토콜의 끝 부분 침전물 미립자 자료에)와 관련된 단계에 사용되어야합니다. 튜브는 밀봉 할 수있는 한 특별한 재료는 것이 좋습니다없고, 생화학 실험실에있는 일반적인 폴리 프로필렌 튜브가 잘 작동합니다. 안전 우려와 폐기물 처리의 측면에서 표준 실험실주의 사항은 (안전 안경, 연기 후드)와 협력, 그리고 농축 아세트산, 염산 또는 황산 산을 포함하는 솔루션을 처분 사전 벗긴 껍질에서 행사되어야한다. 같은 유기 시약에 대한 orcinol 또는 diphenylamine, 니트릴 장갑은 일반적인 라텍스 (천연 고무) 다양한 바람직합니다.