Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Resumen

Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Resumen

Experimentación bioquímica general, requiere el conocimiento exacto, en una etapa temprana, del ácido nucleico, proteína y otros componentes biomoleculares en muestras potencialmente heterogéneos. Los ácidos nucleicos pueden ser detectados a través de varios métodos establecidos, incluyendo métodos analíticos que son espectrofotométrico (por ejemplo, A _260), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tintes fluorescentes), o colorimétrico (nucleósidos específicos de reacciones químicas cromogénicos). ¹ A pesar de que no puede distinguir fácilmente ARN a partir de ADN, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ se emplea comúnmente, ya que ofrece una simple y rápida ² evaluación del contenido relativo de ácido nucleico, que absorbe predominantemente cerca de 260 nm y proteínas, que absorbe principalmente cerca de 280 nm. Ratios <0,8 se toman como indicadores de muestras "puras" de proteínas, mientras que el ácido nucleico puro (NA) se caracteriza por relaciones de> 1,5 ^3.

Hobargo, hay escenarios en los que el contenido de proteína / NA no puede ser tan clara o fiable inferirse de simples uv-vis medidas espectrofotométricas. Por ejemplo, (i) muestras podrá contener una o más proteínas que son relativamente carente de los aminoácidos aromáticos responsables de la absorción a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como es el caso con algunos pequeños ARN-proteínas de unión, y (ii) muestras pueden exhibir intermedio A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratios (~ 0,8 <~ 1,5), donde el contenido de proteína / NA es mucho menos clara e incluso pueden reflejar algunos de alta afinidad de la asociación entre la proteína y componentes de NA. Para tales escenarios, se describe en la presente memoria un conjunto de ensayos colorimétricos para distinguir rápidamente ARN, ADN, y azúcares reductores en una muestra mixta potencialmente de biomoléculas. Los métodos se basan en la sensibilidad diferencial de las pentosas y otros hidratos de carbono a Benedict, Bial (orcinol), y reactivos de Dische (difenilamina); los protocolos simplificados puede ser comcompletado en cuestión de minutos, sin ningún paso adicional de tener que aislar los componentes. Los ensayos pueden realizarse en paralelo a diferenciar entre ARN y ADN, así como para indicar la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa y ribosa (Figura 1).

Introducción

Gran parte de la biología celular se produce a través de interacciones moleculares que interviene el ADN y el ARN. ⁴ Estos ácidos nucleicos de origen natural (AN) interactúan entre sí, con las proteínas, ⁵ y ⁶ con una serie de compuestos de pequeñas moléculas y ligandos in vivo (por ejemplo, cationes divalentes ^7). Las interacciones pueden ser de corta o de larga duración (cinéticamente), puede variar de alta a moderada a baja afinidad (fuerza termodinámica), y también pueden mostrar una variación sustancial en las propiedades químicas y la especificidad - algunas asociaciones son muy específicas (por ejemplo, ADN · · · los factores de transcripción, ARN · · · los factores de empalme), mientras que otras interacciones son necesariamente mucho más genérico (por ejemplo, el ADN · · · bacterianas histona-como las proteínas HU ^8). Interacciones no específicas con AN pueden tener consecuencias prácticas para los experimentos in vitro de mezclas de Biomolecules, ya que es posible, e incluso probable, que algunos AEs se asociará con las biomoléculas de interés, al menos en algún subconjunto de las condiciones experimentales que se utilizan (fuerza iónica, pH de la solución, etc.)

Consideremos, por ejemplo, la producción de una proteína de interés (POI) a través de la sobre expresión heteróloga de la proteína recombinante en cultivo de células de Escherichia coli; tal procedimiento se realiza rutinariamente en prácticamente cualquier laboratorio de biología estructural ⁹ En la preparación para experimentos adicionales, tales. como caracterización bioquímica / biofísica, cristalización, etc., los esfuerzos iniciales se centran generalmente en la obtención de una cantidad suficiente de la PDI en una forma tan pura como sea posible, idealmente como un espécimen químicamente homogénea y monodispersas biofísicamente. Después de la interrupción de las células huésped, las primeras etapas de purificación de un flujo de trabajo típico para aislar el objetivo de PDI de E. coli proteínas, ácidos nucleicos, restos de pared celular,y otros componentes del lisado celular. Sin embargo, host NAS puede co-purificar con el POI por varias razones fisicoquímicas - un PDI altamente básica puede no específicamente desplegable anfitrión de ADN / ARN, el POI puede tener un genérico NA actividad de unión (por ejemplo, el antes mencionado HU); el POI puede ser un bastante específico NA-proteína de unión, pero presentan reactividad cruzada con los ARN o ADN de acogida; anfitrión AN puede interactuar con una matriz de cromatografía y por lo tanto simplemente co-eluir con la PDI, y así sucesivamente. Indiscriminada, de alta afinidad de unión de anfitrión NAS a un POI puede plantear un problema molesto ya que las impurezas NA es probable que interferir con los experimentos posteriores (por ejemplo, ensayos de fluorescencia de anisotropía de POI unión • ARN ^10). Alternativamente, el PDI no anticipado · · · asociaciones NA también puede ser visto por casualidad, como tales interacciones iluminar el PDI ácido nucleico capacidad de unión. De cualquier manera, si AN son componentes claves o contaminantes, primero hay que cuantificar yidentificar el tipo (ADN, ARN) de AN co-purificación en preparación para experimentos posteriores.

Varios existen métodos analíticos para la detección y cuantificación de AN en una muestra. La mayoría de los métodos disponibles son fundamentalmente ya sea espectrofotométrico (por ejemplo, A ₂₆₀ y A valores de absorbancia ₂₆₀ / A ₂₈₀ coeficientes), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tiazol naranja u otros colorantes fluorescentes a NA), o colorimétrico (susceptibilidad de nucleósidos para reacciones químicas que cromóforos absorbentes de rendimiento en la región UV-Vis del espectro electromagnético), como se describió recientemente por De Mey et al. ¹ Sin embargo, el paso crucial de identificar el tipo de polinucleótido como ARN o ADN está más allá del alcance de muchos de estos cuantificación enfoques. Aquí se proporciona un conjunto de ensayos colorimétricos para identificar rápidamente los tipos de componentes de NA en una muestra proteica.

Los protocolos descritos aquí cun ser ejecutados eficientemente sin etapas adicionales de aislamiento de las posibles impurezas de NA, y se basan en el ensayo de Benedict para azúcares reductores ^11, el ensayo de orcinol para pentosas ^{12,13, 14,15} y reacciones de difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 y 2) . Prueba de la Benedict (Figura 2a) utiliza la capacidad de la forma lineal, de cadena abierta (aldehído) de un azúcar aldosa para reducir Cu ^{2 +,} con la oxidación concomitante de carbonilo del azúcar a un resto carboxilato y producción de Cu ₂ O como un precipitado de color rojo insoluble. Esta reacción tendrá un resultado positivo con libres de azúcares reductores tales como aldosas y cetosas (que se convierten en las aldosas correspondientes a través de productos intermedios enediol), pero no con los azúcares de pentosa que están bloqueados en forma cíclica como parte del esqueleto covalente de un ADN o polinucleótido de ARN. Debido a la exigencia minimalista de una funcionalidad hemiacetal libre, co otrompounds que podrían dan positivo en este ensayo - y por lo tanto actuar como interferentes potenciales - incluyen α-hidroxi-cetonas y oligosacáridos cortos (por ejemplo, el disacárido maltosa). Tanto el de Bial orcinol (Figura 2b) y difenilamina Dische (Figura 2c), las reacciones se basan en la destrucción inicial de la columna vertebral de polinucleótido, a través de la despurinización del nucleósido y ácido-o adicionalmente catalizada por base hidrólisis de los nucleótidos matrices, para dar furano-2 -carbaldehído (furfural) derivados; estos derivados luego reaccionar ya sea con un polihidroxi fenol tal como orcinol (Bial) o difenilamina (Dische de) los reactivos para formar productos coloreados de condensación de estructura química en gran medida desconocido. El ADN frente a la especificidad de ARN de ensayo de la Dische se deriva del hecho de que el azúcar pentosa debe ser 2'-desoxigenado con el fin de ser susceptible a la oxidación a ω-hydroxylevulinyl aldehído, que además reacciona con difenilaminaen condiciones ácidas para producir un color azul brillante de condensado (Figura 2c). Utilizando los protocolos simplificados descritos aquí, se ha encontrado que estas reacciones colorimétricas específicas de azúcar puede diferenciar entre ARN y ADN, y también indican la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa, ribosa o en una muestra biomolecular.

Protocolo

1. Ensayo de Benedicto XVI para la reducción de azúcares

1. Preparar una cantidad apropiada de reactivo de Benedict - 940 mM de carbonato de sodio anhidro, 588 mM de sodio dihidrato de citrato, 68 mM de cobre (II) pentahidrato de sulfato. Este reactivo puede almacenarse a temperatura ambiente (RT) durante al menos seis meses sin ningún cambio notable en la reactividad.
2. El reactivo anterior es 6x. Así, para 600 reacciones mu l, añadir 100 l de reactivo de Benedict a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml (por ejemplo, Eppendorf marca), por muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo, el volumen óptimo se puede determinar basándose en la intensidad de formación de color en un periodo de prueba inicial. Si la muestra se dispone de suficiente entonces comenzar tales ensayos en el volumen de muestra máximo posible (es decir, las cinco sextas partes del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso), y luego se diluye en los ensayos posteriores.
4. Añadir ddH ₂ O para el tuser para llevar el volumen final a 600 l; mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia.
9. Ponga el espectrofotómetro UV-vis con agua.
10. Medir la absorbancia de la muestra a 475 nm.

2. Ensayo orcinol Bial para pentosas

1. Preparar una cantidad adecuada de reactivo fresco de Bial - 24,2 mM monohidrato de orcinol (véase la figura 2b para la estructura de este compuesto), 6 M de HCl, 0,025% w / v cloruro férrico hexahidratado Nota.:Para un almacenamiento prolongado, el reactivo Bial se pueden preparar como dos soluciones madre por separado: (i) del Reactivo A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O en HCl concentrado] y (ii) Reactivo B [422 mM de monohidrato de orcinol preparado en 95 % de etanol]. El reactivo A se puede almacenar a temperatura ambiente durante seis meses; Reactivo B se puede almacenar a 4 ° C durante un mes, cubierto con papel de aluminio para limitar la exposición de la luz. Estas soluciones madre se mezclaron en un 15 (A): 1 (B) proporción v / v antes de su uso.
2. El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Bial a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí.
4. Añadir ddH ₂ O al tubo para llevar el final volumen a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual.
9. Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 660 nm.

3. Ensayo Dische de difenilamina para 2'-desoxipentosa Azúcares

1. Preparar una cantidad adecuada de reactivo Dische de difenilamina - 60 mM difenilamina, 11 M de ácido acético glacial, 179 mM de ácido sulfúrico, 62% v / v de etanol. Este reactivo puede ser preen comparación con antelación y se almacena a temperatura ambiente en un recipiente oscuro, o cubierto con papel de aluminio, para limitar la exposición a la luz. Debido a la sensibilidad a la luz que el reactivo no se deben almacenar indefinidamente, aunque en la práctica puede ser preparado cada dos a tres meses sin cambio aparente en la reactividad.
2. El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Dische a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí.
4. Añadir ddH ₂ O al tubo para llevar el volumen final a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retire la muestra caliente de la bañera y la asignaciónw que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual.
9. Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 600 nm.

4. Otras indicaciones de uso

1. Las siguientes clases de moléculas son compuestos de referencia adecuados para reacciones de control positivas y negativas para cada ensayo:
   • Benedicto XVI - Positivo = libre ribosa, fructosa, glucosa, Negativo = ARN, ADN, ATP, etc. (Cualquier sacárido carece de una funcionalidad sin azúcares reductores)
   • Bial - Positivo = ARN (por ejemplo, extracto de levadura de panadero), la ribosa, ATP, UMP, negativo = bovina serviciosum albúmina (BSA) o cualquier otra proteína
   • Dische de - Positivo = ADN (por ejemplo, de timo de ternera), negativo = ARN, ATP, etc. (Cualquier nucleótido no-2'-desoxigenada)
2. Estos ensayos se han encontrado para ser bastante resistentes a los compuestos a menudo utilizados en la purificación de proteínas, por ejemplo, sales comunes, tales como NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, y K ₂ SO ₄ no interfieren, y las reacciones aparecen generalmente no afectados por el contenido del diluyente. Detergentes o agentes caotrópicos, tales como urea pueden afectar a la reactividad de los ensayos si el pH es altamente básico; un neutro a intervalo de pH ácido es generalmente más óptima para la de Bial y ensayos Dische a causa de la química de la reacción subyacente (ver el texto y los protones de los en la Figura 2b, c). Potencialmente subóptimas condiciones de reacción, interferentes sospechosos, etc. debe ser probado en una base de caso por caso, con control positivo y negativo experimentos with compuestos de referencia.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 3 para la aplicación de estos ensayos colorimétricos para los compuestos de referencia conocidos. Los datos representativos se muestran cualitativos para (a), el orcinol Benedict Bial (B), y Dische de difenilamina (c) ensayos, y las curvas de calibración para estos tres ensayos se muestran en la Figura 4. En los paneles 3 (AC), los paneles de la izquierda muestran positivos / negativos experimentos de control usando analitos adecuadamente react...

Discusión

Los ensayos colorimétricos se presenta aquí ofrecer un enfoque sencillo para evaluar rápidamente la naturaleza química de las mezclas de biomoléculas, tales como se encuentran cuando la purificación de proteínas, ARN o complejos de lisado de células enteras en preparación para estudios posteriores. Como la biología estructural persigue asambleas más similar a la nativa, los retos cada vez mayores, como la heterogeneidad de la muestra, se plantean los complejos complicados y multi-componente. Supramolecu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo o equipo	Proveedor / empresa	El número de catálogo	Comentarios, notas
Carbonato de sodio anhidro	Fisher Scientific	S263
Sodio dihidrato de citrato	Sigma	S-4641
Cobre (II) sulfato pentahidratado	VWR	VW3312-2
Monohidrato de orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrado	VWR	BDH3030
Cloruro de hierro hexahidratado	Sigma	F-2877
Difenilamina	Aldrich	112763
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A28
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Ribosa	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v en H 2 O
El ácido ribonucleico de levadura (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a -20 ° C
El ácido desoxirribonucleico (sal de sodio), a partir de timo de ternera	Sigma	D1501	prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a 4 ° C
			Los reactivos, equipos y Seguridad Los materiales se enumeran en la foguientes tabla en el orden en que aparecen en la sección de Protocolo. A menos que se indique lo contrario (arriba), todos los reactivos pueden almacenarse a temperatura ambiente y la iluminación. Para cualquier artículo no se enumeran a continuación (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), la marca habitual / modelo / variedad que se encuentra en un laboratorio de bioquímica estándar se puede utilizar (por ejemplo, Eppendorf de 1,5 ml marca tubos de microfuga). Estándar tubos de microcentrífuga de plástico se debe utilizar para los pasos que implican centrifugación (por ejemplo, para material de sedimento de partículas cerca del final de cada protocolo). Ningún material en particular es preferible, siempre y cuando los tubos puede ser sellada; los tubos de polipropileno típicos que se encuentran en los laboratorios de bioquímica funcionan bien. En cuanto a las preocupaciones de seguridad y eliminación de residuos, las precauciones estándar de laboratorio (gafas de seguridad, campanas de extracción) debe ser ejercida de pre-parar, trabajando, y disponer de soluciones que contienen concentrado acético, clorhídrico o sulfúrico. Para los reactivos orgánicos como orcinol o difteriaenilamina, guantes de nitrilo son preferibles al látex común (caucho natural) variedad.