Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Zusammenfassung

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Zusammenfassung

Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A _260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). ¹ Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A ₂₆₀ / A _{280-Verhältnis} wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen ² Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios <0,8 werden als Indikator für die "reinen" Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist> 1,5 ^3.

However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A ₂₆₀ / A _{280-Verhältnisse} (~ 0,8 <~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).

Einleitung

Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. ⁴ Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, ⁵ mit Proteinen, ⁶ und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen ^7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität - einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine ^​​8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.).

Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt ⁹ In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern - ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung ¹⁰⁾ stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche.

Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A ₂₆₀ Extinktionswerte und A ₂₆₀ / A _{280-Verhältnisse),} fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. ¹ Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe.

Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker ^11, das Orcinol-Assay für Pentosen ^{12,13, 14,15} und Diphenylamin Reaktionen von 2'-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu ^{2 +,} unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu ₂ O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte - und wirken somit als potenzielle Störfaktoren - gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2'-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.

Protokoll

Ein. Benedikt Assay für reduzierende Zucker

1. Bereiten Sie eine geeignete Menge von Benedict-Reagenz - 940 mM wasserfreies Natriumcarbonat, 588 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 68 mM Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat. Dieses Reagenz kann bei Raumtemperatur (RT) für mindestens sechs Monate ohne merkliche Änderung der Reaktivität gespeichert werden.
2. Das obige Reagenz 6x. So 600 ul Reaktionen, mit 100 ul von Benedikt-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf-Marke), pro Probe untersucht werden.
3. Hinzufügen zwischen 10 ul und 500 ul Probe auf diesem Rohr, das optimale Volumen kann auf der Basis der Intensität der Farbbildung in einem anfänglichen Probelauf ermittelt werden. Wenn ausreichend Probe ist dann beginnen solche Studien an der maximal mögliche Probenvolumen (dh fünf Sechstel des gesamten Reaktionsvolumen, 500 ul der Probe in diesem Fall), und dann verdünnen anschließenden Tests.
4. Fügen ddH ₂ O an der TUsein, um das Endvolumen auf 600 ul bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen.
7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette.
9. Blank UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser.
10. Die Extinktion dieser Probe bei 475 nm.

2. Bial Orcinol Assay für Pentosezucker

1. Bereiten Sie eine geeignete Menge an frischem Bial-Reagenz - 24,2 mM Orcin Monohydrat (siehe Abbildung 2b für die Struktur dieser Verbindung), 6 M HCl, 0,025% w / v Eisenchloridhexahydrat. Hinweis:Für eine längere Lagerung können die Bial-Reagenz als zwei separate Stammlösungen hergestellt werden: (i) Reagenz A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O in konzentrierter HCl] und (ii) Reagenz B [422 mM Orcin Monohydrat in 95 vorbereitet % Ethanol]. Reagenz A kann bei RT für sechs Monate gelagert werden; Reagenz B können bei 4 ° C einen Monat gelagert werden, mit einer Folie zu Belichtung zu begrenzen. 1 (B) v / v-Verhältnis vor Gebrauch: Diese Stammlösungen werden in einem 15 (A) gemischt.
2. Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Bial-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden.
3. Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen.
4. Hinzufügen ddH ₂ O, um das Rohr um den f bringeninal Volumen auf 1,0 ml; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen.
7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung.
9. Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 660 nm.

3. Disches Diphenylamin Assay für 2'-deoxypentose Zucker

1. Bereiten Sie eine geeignete Menge Disches Diphenylamin Reagenz - 60 mM Diphenylamin, 11 M Eisessig, 179 mM Schwefelsäure, 62% v / v Ethanol. Dieses Reagenz kann vorbestellt werdenVergleich im Voraus und bei RT in einem dunklen Behälter oder mit Folie abgedeckt, um Belichtung begrenzen. Aufgrund Lichtempfindlichkeit sollte das Reagenz nicht unbegrenzt gelagert werden, obwohl in der Praxis kann es alle zwei bis drei Monate ohne sichtbare Veränderung in der Reaktivität vorbereitet werden.
2. Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Disches Reagens an ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden.
3. Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen.
4. Fügen ddH ₂ O an das Rohr, um das Endvolumen auf 1,0 ml zu bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und allow es bei RT für 10 min abkühlen gelassen.
7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung.
9. Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 600 nm.

4. Weitere Hinweise zur Verwendung

1. Die folgenden Klassen von Molekülen eignen Referenzsubstanzen für positive und negative Kontrollreaktionen für jeden Assay:
   • Benedikt - Positive = freie Ribose, Fructose, Glucose, Negative = RNA, DNA, ATP, etc. (Alle Saccharid fehlt eine kostenlose reduzierenden Zucker-Funktionalität)
   • Bial - Positive = RNA (zB Bäcker Hefe-Extrakt), Ribose, ATP, UMP, Negative = bovine serum Albumin (BSA) oder jedes andere Protein
   • Disches - Positive = DNA (zB Kalbsthymus); Negativ = RNA, ATP, etc. (Alle nicht-2'-desoxygeniertem Nukleotid)
2. Diese Assays haben sich als ziemlich elastisch ist, um Verbindungen häufig in der Proteinreinigung eingesetzt, so z. B. gemeinsame Salze wie NaCl, (NH _{4) 2} SO ₄ und K ₂ SO ₄ nicht stören, und die Reaktionen im Allgemeinen erscheinen unberührt der Inhalt des Verdünnungsmittels. Detergenzien oder chaotropen Agenzien wie Harnstoff kann sich auf die Reaktivität der Assays, wenn der pH-Wert hochbasischen; einem neutralen bis sauren pH-Bereich liegt in der Regel optimal für die Bial und Disches Assays aufgrund der darunterliegenden Reaktions Chemie (siehe den Text und die Protonen in Abbildung 2b, c). Potenziell suboptimal Reaktionsbedingungen, vermutete Störkomponenten, etc. sollten auf einer Fall-zu-Fall-Basis getestet werden, wobei positive und negative Kontrolle Experimenten with Referenz-Verbindungen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 für die Anwendung dieser kolorimetrische Assays bekannt Referenzsubstanzen gezeigt. Vertreter qualitative Daten für die Benedikt (a), Orcin (b) Bial und Disches Diphenylamin (c) Assays gezeigt, und Standard-Kurven für diese drei Tests sind in Abbildung 4 dargestellt. Einsatzplatten 3 (ac) zeigen die linke Felder positive / negative Kontrollexperimente unter Verwendung geeigneter reaktiver / unreaktiv Analyten; diese visuellen Ergebnisse sind in ...

Diskussion

Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz oder Ausrüstung	Lieferant / Firma	Katalognummer	Kommentare, Notizen
Wasserfreies Natriumcarbonat	Fisher Scientific	S263
Natriumcitratdihydrat	Sigma	S-4641
Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat	VWR	VW3312-2
Orcinol Monohydrat	Sigma-Aldrich	O1875
Konzentrierte HCl	VWR	BDH3030
Eisenchloridhexahydrat	Sigma	F-2877
Diphenylamin	Aldrich	112763
Eisessig	Fisher Scientific	A28
Schwefelsäure	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep bei 1% w / v in H 2 O
Ribonukleinsäure aus Bäckerhefe (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep bei 10 mg / ml in H 2 O; bei -20 ° C
Desoxyribonukleinsäure (Natriumsalz), aus Kalbsthymus	Sigma	D1501	prep bei 10 mg / ml in H 2 O; lagern bei 4 ° C
			Reagenzien, Geräte und Sicherheit Die Materialien werden in der fo aufgeführtllowing Tabelle in der Reihenfolge, in der sie in dem Protokoll Abschnitt. Soweit nicht anders vermerkt (siehe oben), können alle Reagenzien bei Raumtemperatur und Beleuchtung gespeichert werden. Für alle Posten, die nicht unten aufgeführt (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen), kann die übliche Marke / Modell / Sorte fand in einem Standard biochemischen Labor eingesetzt (z. B. Marke Eppendorf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen) werden. Standard-Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sollte Schritte, welche Zentrifugation (zB zu sedimentieren Partikelmaterial in der Nähe des Ende jedes Protokoll) verwendet werden. Keine spezielle Material ist bevorzugt, solange die Rohre abzudichten; die typischen Polypropylenröhrchen in Biochemie Laboratorien gefunden funktionieren gut. In Bezug auf die Sicherheit Bedenken und Entsorgung, sollte Standard-Labor-Vorsichtsmaßnahmen (Schutzbrille, Abzugshauben) bei der Aufstellung ausgeübt werden, die Arbeit mit und die Entsorgung von Lösungen mit konzentrierter Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Für organische Reagenzien wie Orcin oder diphenylamin sind Nitril vorzuziehen gemeinsamen Latex (Naturkautschuk) Vielfalt.