Быстрое колориметрических тестов на качественно Различают РНК и ДНК в биомолекулярных образцов

Резюме

Набор колориметрических тестов описан быстро отличительной белков, РНК, ДНК, и вновь ducing сахара в потенциально гетерогенных образцов биомолекул.

Аннотация

Биохимические эксперименты как правило, требует точного знания, на ранней стадии, в состав нуклеиновых кислот, белков и других компонентов биомолекулярной в потенциально гетерогенных образцов. Нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены через несколько устоявшиеся подходы, включая аналитические методы, которые спектрофотометрического (например, _260), флуорометрической (например, связывания флуоресцентных красителей), или колориметрическим (нуклеозид конкретных хромогенных химических реакций). ¹ Хотя это не легко отличить РНК от ДНК, ₂₆₀ / A ₂₈₀ отношение обычно используется, так как она предлагает простой и быстрый ² Оценка относительного содержания нуклеиновых кислот, которые поглощают преимущественно вблизи 260 нм и протеина, который поглощает в основном вблизи 280 нм. Коэффициенты <0,8 принимаются как показатель «чистые» образцы белка, в то время как чистая нуклеиновой кислоты (NA) характеризуется отношение> 1,5 ^3.

HoWever, существуют сценарии, в которых белок / NA содержание не может быть столь же четко и надежно вывести из простого UV-VIS спектрофотометрического измерения. Например, (я) образцы могут содержать один или несколько белков, которые являются относительно лишенной ароматические аминокислоты отвечают за поглощение при ≈ 280 нм (Trp, Tyr, Phe), как и в случае с некоторыми малыми РНК-связывающие белки, и (II), образцы могут проявлять промежуточные A ₂₆₀ / A ₂₈₀ соотношения (~ 0.8 <~ 1.5), где белок / NA содержание гораздо менее ясен и даже может отражать некоторые высоким сродством связь между белком и Н. А. компонентов. Для такого сценария, мы опишем здесь набор колориметрические анализы быстро отличать РНК, ДНК, и снижение сахара в потенциально смешанного образца биомолекул. Методы опираются на различную чувствительность пентоз и других углеводов, чтобы Бенедикта, Bial (в орцинола), и Дише (в дифениламина) реагентов; обтекаемой протоколов может быть комзавершена в течение нескольких минут, без каких-либо дополнительных шагов от того, чтобы изолировать компоненты. Анализы могут выполняться параллельно проводить различие между ДНК и РНК, а также указывают на наличие свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза и (рис. 1).

Введение

Большая часть клеточной биологии происходит через молекулярные взаимодействия с участием ДНК и РНК. ⁴ Эти естественные нуклеиновых кислот (НО) взаимодействуют друг с другом, ⁵ с белками, ⁶ и с множеством малых молекул соединений и лигандов в естественных условиях (например, двухвалентных катионов ^7). Взаимодействия могут быть кратко-или долгосрочных (кинетически), могут варьироваться от умеренных до высоких к низким сродством (термодинамические силы), а также может обладать существенным изменением химических свойств и специфики - некоторые ассоциации являются достаточно специфическими (например, ДНК · · факторы транскрипции, РНК · · · факторы сплайсинга), в то время как другие взаимодействия обязательно являются гораздо более общие (например, ДНК · · · бактериальный гистона-подобных белков HU ^8). Non-специфическими взаимодействиями с НСБУ может иметь практические последствия для лабораторного эксперимента с участием смесей biomolecules, как это возможно, и даже вероятно, что некоторые ВПЛ будут ассоциировать с биомолекул интерес, по крайней мере в некоторое подмножество экспериментальных условиях используются (ионной силы, рН раствора и т.д.).

Рассмотрим, например, производство белка интереса (POI) через гетерологичных чрезмерной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia культуре клеток кишечной; такая процедура обычно выполняется практически в любой лаборатории структурной биологии ⁹ В подготовкой для дальнейших экспериментов, например. как биохимическая / биофизических характеристик, кристаллизация, и т.д.., первоначальные усилия правило, сосредоточены на получении достаточного количества POI в качестве чистой, по возможности, идеально, как химически однородной и биофизически монодисперсных образцов. После разрушения клеток-хозяев, на ранних стадиях типичный рабочий процесс очистки стремиться изолировать POI из E. палочки белков, нуклеиновых кислот, мусор клеточной стенки,и другие компоненты клеточных лизатов. Тем не менее, хозяин NAS может совместно очищают с POI в течение нескольких физико-химических причин - очень основной POI могут неспецифически выпадающего хозяин ДНК / РНК; POI могут иметь общие NA-связывающей активности (например, вышеупомянутый HU); POI может быть достаточно конкретным NA-связывающего белка, но экспонат перекрестной реактивности с принимающей РНК или ДНК, принимающих NAS может взаимодействовать с матрицей хроматографии и тем самым просто совместно элюируются с POI, и так далее. Неизбирательное, высокое сродство связывания хозяин NAs к POI могут представлять неприятная проблема, потому что НС примесей, скорее всего, мешают вниз по течению экспериментов (например, анализы флуоресценции анизотропии POI • связывание РНК ^10). Кроме того, непредвиденные POI · · · НС ассоциации также могут быть просмотрены случайно, так как такое взаимодействие освещения нуклеиновой кислоты связывающей способности POI автора. В любом случае, независимо от того НАН Украины являются ключевыми компонентами или загрязняющих веществ, нужно сначала количественно иопределить тип (ДНК, РНК) совместной очистки НАН Украины в подготовке к вниз по течению экспериментов.

Некоторые аналитические методы для обнаружения и количественного НАН Украины в образце. Большинство из доступных методов принципиально либо спектрофотометрический (например, A ₂₆₀ значения абсорбции и ₂₆₀ / A ₂₈₀ коэффициентов), флуорометрической (например, связывание тиазола оранжевого или других флуоресцентных красителей НС), или колориметрическим (восприимчивость нуклеозидов в химических реакциях что выход хромофоров поглощающие в УФ-VIS области электромагнитного спектра), а недавно описаны де Мей и др. ^1. Тем не менее, важным шагом в определении типа полинуклеотид как РНК или ДНК, выходят за рамки многих из этих количественного подходы. Здесь мы предлагаем набор колориметрических тестов для быстрого выявления типов компонентов НС в белковой образца.

Протоколов, описанных здесь сбыть эффективно выполнены без дополнительных мер изоляции потенциальных примесей NA, и полагаться на анализ Бенедикта для снижения сахара ^11, орцинола анализа для пентоз ^12,13 и ^14,15 реакции дифениламина 2'-deoxypentoses (рис. 1 и 2) . Тест Бенедикт (рис. 2а) использует способность линейной, открытой цепью (альдегид) форма альдозы сахара снизить Cu ^{2 +,} с сопутствующей окисление карбонильных сахара в карбоксилат фрагмент и производства Cu ₂ O в качестве нерастворимого красного осадка. Эта реакция будет положительной реакцией с бесплатным снижения сахара, такие как альдоз и кетоз (которые преобразуют в соответствующие альдоз через enediol промежуточные продукты), но не с пентозы сахара, которые зафиксированы в циклической форме, как часть ковалентной основу ДНК или РНК полинуклеотида. В связи с минималистичным требование свободного полуацеталь функциональность, другие сотрудничествеmpounds, которые могли бы положительный результат в этом тесте - и, следовательно, выступать в качестве потенциальных мешающих - включают α-гидрокси-кетоны и коротких олигосахаридов (например, дисахарид мальтозу). И Bial в орцинола (рис. 2б) и Дише в дифениламина (рис. 2, в) реакции основаны на начальном разрушение полинуклеотида позвоночника, через депуринизации нуклеозида и дальнейшего кислоты или основания катализируемого гидролиза родителей нуклеотида, с получением фуран-2 -карбальдегида (фурфурол) производные; эти производные затем реагировать либо с полигидрокси фенола, такие как орцинола (Bial) или дифениламина (Дише автора) реагентами с образованием окрашенных продуктов конденсации в значительной степени неизвестной химической структуры. ДНК по сравнению с РНК специфика анализа Дише проистекает из того факта, что пентозы сахара должно быть 2'-венозная для того, чтобы быть восприимчивым к окислению ω-hydroxylevulinyl альдегид, который далее реагирует с дифениламинав кислых условиях с получением ярко-синий конденсата (рис. 2). Использование обтекаемой протоколов, описанных здесь, мы обнаружили, что эти сахара конкретных колориметрических реакций могут дифференцироваться между РНК и ДНК, а также будет свидетельствовать о наличии свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза или в молекулярно-биологических образцов.

протокол

1. Бенедикт анализа для редуцирующих сахаров

1. Подготовить соответствующее количество реагентов Бенедикта - 940 мм безводного карбоната натрия, 588 мМ цитрат натрия дигидрат, 68 мм меди (II) сульфата пентагидрата. Этот реагент можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение по крайней мере шести месяцев без заметного изменения реактивности.
2. Данный реагент 6x. Таким образом, для 600 мкл реакции, добавить 100 мкл реагентов Бенедикта в чистом 1,5 мл микроцентрифужных трубки (например, Eppendorf бренда), на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе; оптимальный объем может быть определен, исходя из интенсивности цвета образование в начальной пробного пуска. Если достаточное образец доступен затем начать такие испытания при максимальном возможном объеме выборки (т.е. пять шестых от общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае), а затем разбавить в последующих анализах.
4. Добавить DDH ₂ O в тубыть направлена ​​на конечного объема до 600 мкл; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету.
9. Пустым UV-VIS спектрофотометр с водой.
10. Измеряют поглощение этого образца при 475 нм.

2. Орцинола Bial в Пробирной для пентозные сахара

1. Подготовить соответствующее количество реагентов свежие Bial автора - 24,2 мм орцинола моногидрат (см. рис 2b для структуры этого соединения), 6 М HCl, 0,025% вес / объем гексагидрат хлорида железа Примечание.:Для длительного хранения реагента Bial может быть подготовлен в виде двух отдельных решений складе: (I) Реагент [0,05% вес / объем FeCl3 • 6H ₂ O в концентрированной HCl] и (II) Реагент B [422 мм орцинола моногидрат подготовлены в 95 % этанола]. Реагент можно хранить при комнатной температуре в течение шести месяцев; реагент B можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца, покрытый фольгой, чтобы ограничить освещенности. Эти растворы смешивают в 15 (A): 1 (B) / об соотношении перед применением.
2. Данный реагент 2x. Таким образом, в течение 1,0 реакций мл, добавить 500 мкл реагента Bial на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе. По сведению 1,3 (выше), если достаточное образец доступен затем начать судебное разбирательство реакций с использованием максимально возможного объема образца (то есть, половина общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае) и разбавить оттуда.
4. Добавить DDH ₂ O в трубу довести FИнал объеме 1,0 мл; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету для визуального осмотра.
9. Для полуколичественного анализа, пустой UV-VIS спектрофотометр с водой и измеряют оптическую плотность образца кювете при 660 нм.

3. Дифениламин Дише в Пробирной для 2'-deoxypentose Сахара

1. Подготовить соответствующее количество реагентов дифениламина Дише - 60 мМ дифениламина, 11 M ледяной уксусной кислоты, 179 мм серной кислоты, 62% об / об этанола. Этот реагент может быть предварительнопо сравнению заранее и хранить при комнатной температуре в темном контейнере, или покрыта фольгой, чтобы ограничить освещенности. Из-за чувствительности к свету реагентов не должны храниться на неопределенный срок, хотя на практике она может быть подготовлен каждые два-три месяца без видимых изменений реактивности.
2. Данный реагент 2x. Таким образом, в течение 1,0 реакций мл, добавить 500 мкл реагента Дише на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе. По сведению 1,3 (выше), если достаточное образец доступен затем начать судебное разбирательство реакций с использованием максимально возможного объема образца (то есть, половина общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае) и разбавить оттуда.
4. Добавить DDH ₂ O к трубке, чтобы принести окончательный объем в мл 1,0; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и аллож ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету для визуального осмотра.
9. Для полуколичественного анализа, пустой UV-VIS спектрофотометр с водой и измеряют оптическую плотность образца кювете при 600 нм.

4. Далее Замечания по использованию

1. Следующие классы молекул подходящие соединения ссылки для положительного и отрицательного контроля реакции для каждого анализа:
   • Бенедикт - Положительные = свободный рибоза, фруктоза, глюкоза, отрицательные = РНК, ДНК, АТФ, и т.д.. (Любой сахарида не хватает свободного снижения сахара функциональности)
   • Bial автора - Положительные = РНК (дрожжевой экстракт, например, пекаря), рибоза, АТФ, UMP; Отрицательные = бычьего серит альбумина (БСА) или любой другой белок
   • Дише автора - Положительные = ДНК (например, зобной железы теленка); Отрицательные = РНК, АТФ и т.д.. (Любой не-2'-венозная нуклеотид)
2. Эти анализы были найдены, чтобы быть достаточно устойчивыми к соединениям часто используется в очистке белков, например, общие соли, такие как NaCl, (NH _{4) 2} SO ₄ и K ₂ SO ₄ не мешает, и реакции появляются обычно не зависит от Содержание растворителя. Моющие средства или хаотропных агентов, таких как мочевина может повлиять на реактивность анализы, если рН очень основные, нейтральные к кислой области рН, как правило, наиболее оптимальной для Bial и анализы Дише, потому что базовой химии реакции (см. текст и протонов на рисунке 2, б). Потенциально оптимальным условиям реакции, мешающих подозреваемых, и т.д.. должны быть проверены в каждом конкретном случае на индивидуальной основе, используя положительные и отрицательные контрольные эксперименты сого соединения ссылки.

Результаты

Результаты представлены на рисунке 3 для применения этих колориметрических тестов с известными соединениями ссылки. Представитель качественные данные приведены для (а), Бенедикт Bial в орцинола (б) и Дише в дифениламина (C) анализы, и стандартные кривые для этих трех анализов пок?...

Обсуждение

Колориметрических тестов, представленные здесь предлагают простой подход к быстрой оценки химической природы биомолекулярных смесей, таких как встречаются при очистке белков, РНК или комплексы из цельного клеточный лизат в подготовке для дальнейших исследований. Как структурной...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагенты и оборудование	Поставщик / компании	Номер в каталоге	Комментарии, примечания
Безводный карбонат натрия	Fisher Scientific	S263
Дигидрат цитрат натрия	Сигма	S-4641
Медь (II) сульфат пентагидрат	VWR	VW3312-2
Орцинола моногидрат	Sigma-Aldrich	O1875
Концентрированная HCl	VWR	BDH3030
Гексагидрат хлорида железа	Сигма	F-2877
Дифениламина	Aldrich	112763
Ледяная уксусная кислота	Fisher Scientific	A28
Серная кислота	Sigma-Aldrich	258105
Этанол	Koptec	V1101
Рибоза	Сигма	R-7500	Подготовка на 1% в / в H 2 O
Рибонуклеиновой кислоты из пекарских дрожжей (S. CEREVISIAE)	Сигма	R6750	Подготовка в дозе 10 мг / мл в H 2 O; хранить при -20 ° C
Дезоксирибонуклеиновой кислоты (натриевая соль), из зобной железы теленка	Сигма	D1501	Подготовка в дозе 10 мг / мл в H 2 O; хранить при 4 ° C
			Реагенты, оборудование и безопасность Материалы, приведенные в лllowing таблице в том порядке, в котором они появляются в протоколе разделе. Если не указано иное (см. выше), все реагенты можно хранить при комнатной температуре и освещении. Для любых предметов, не указанных ниже (например, микроцентрифужных труб), обычные марки / модели / множестве встречаются в стандартных биохимических лабораторий могут быть использованы (например, Eppendorf бренд 1,5 мл микроцентрифуге трубы). Стандартные пластиковые трубы микроцентрифуге следует использовать для шагов с участием центрифугирования (например, осадка частиц материала в конце каждого протокола). Нет конкретного материала является более предпочтительным, поскольку трубки могут быть закрыты; типичный Трубы полипропиленовые найдены в лаборатории биохимии хорошо работать. С точки зрения проблем безопасности и утилизации отходов, стандартные меры предосторожности лаборатории (защитные очки, вытяжные шкафы) должны осуществляться в предварительной очистки овощей, работа с и утилизации растворов, содержащих концентрированной уксусной, соляной или серной кислоты. Для органических реагентов, таких как орцинола или diphenylamine, нитриловые перчатки предпочтительнее общего латекса (натурального каучука) разнообразие.