Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Riepilogo

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Abstract

Sperimentazione biochimica generalmente richiede una conoscenza accurata, in una fase iniziale, l'acido nucleico, proteine ​​e altri componenti biomolecolari in campioni potenzialmente eterogenei. Gli acidi nucleici possono essere rilevati tramite diversi approcci stabiliti, compresi metodi analitici spettrofotometrico (ad esempio, A _260), fluorometrico (ad esempio, il legame di coloranti fluorescenti), o colorimetrica (nucleoside-specifiche reazioni chimiche cromogeni). ¹ Anche se non può facilmente distinguere RNA da DNA, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporto è comunemente impiegato, in quanto offre un semplice e rapido ² valutazione del contenuto relativo di acido nucleico, che assorbe prevalentemente vicino 260 nm e proteine, che assorbe principalmente vicino 280 nm. Rapporti <0,8 sono presi come indicativo di "puri" i campioni di proteine, mentre il puro acido nucleico (NA) è caratterizzata da rapporti di> 1,5 ^3.

HoWever, ci sono scenari in cui la proteina / NA contenuto non può essere nel modo più chiaro e affidabile dedurre da semplici misure spettrofotometriche UV-VIS. Per esempio, (i) i campioni possono contenere una o più proteine ​​che sono relativamente privo degli amminoacidi aromatici responsabili di assorbimento a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), come è il caso con alcuni piccoli RNA-binding proteins, e (ii) i campioni possono presentare intermedi A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti (~ 0.8 <~ 1.5), dove la proteina / NA contenuto è molto meno chiara e può anche riflettere un po 'alta affinità associazione tra la proteina e componenti NA. Per tali scenari, si descrive qui una suite di test colorimetrici per distinguere rapidamente RNA, DNA, e zuccheri riduttori in un campione potenzialmente misto di biomolecole. I metodi si basano sulla sensibilità differenziale di pentosi e altri carboidrati a Benedetto, Bial di (orcinol), e di Dische (difenilammina) reagenti; protocolli ottimizzati possono essere comcompletato in pochi minuti, senza ulteriori passaggi di dover isolare i componenti. I saggi possono essere eseguiti in parallelo per distinguere tra RNA e DNA, così come indica la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio e (Figura 1).

Introduzione

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. ⁴ Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, ^{5, 6} con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti ^7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità - alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fattori di splicing), mentre le altre interazioni sono necessariamente molto più generico (ad esempio, il DNA · · · batteriche come le proteine ​​istone-HU ^8). Non specifiche interazioni con agenzie nazionali possono avere conseguenze pratiche per gli esperimenti in vitro che coinvolgono miscele di biomolecules, in quanto è possibile, e anche probabile, che qualche AN assocerà con le biomolecole di interesse, almeno in alcuni sottoinsieme delle condizioni sperimentali impiegate (forza ionica, pH soluzione, ecc).

Si consideri, ad esempio, la produzione di una proteina di interesse (POI) eterologa tramite sovra-espressione della proteina ricombinante in coltura di cellule di Escherichia coli, tale procedura viene eseguita di routine in qualsiasi laboratorio di biologia strutturale ⁹ Nella preparazione per ulteriori esperimenti, quali. come caratterizzazione biochimica / biofisica, cristallizzazione, ecc., sforzi iniziali in genere in modo di ottenere una sufficiente quantità di POI come pura forma possibile, idealmente come un campione chimicamente omogenea e biofisico, monodisperse. Dopo la rottura di cellule ospiti, le prime fasi di un flusso di lavoro tipico purificazione lo scopo di isolare il POI da E. coli proteine, acidi nucleici, parete detriti cellulari,e altri componenti del lisato cellulare. Tuttavia, AN ospite può co-purificare con il POI per diversi motivi fisico - un POI fortemente basico può non specificamente tendina ospitante DNA / RNA, il POI può avere un generico NA attività di legame (ad esempio, il già citato HU); il POI può essere abbastanza specifico NA-binding protein ma mostra reattività crociata con RNA host o DNAs; ospitante AN può interagire con una matrice di cromatografia e quindi semplicemente co-eluire con il POI, e così via. Indiscriminato, ad alta affinità di legame di host AN verso un PDI può rappresentare un problema fastidioso in quanto le impurità NA probabilmente interferire con gli esperimenti a valle (ad esempio, analisi di anisotropia di fluorescenza di POI • RNA binding ^10). In alternativa, POI imprevisto · · · associazioni NA può essere visto anche fortuitamente, come tali interazioni illuminare il POI acido nucleico capacità di legame. In entrambi i casi, se AN sono componenti chiave o contaminanti, si deve prima quantificare eidentificare il tipo (DNA, RNA) di co-purificazione AN in preparazione per esperimenti a valle.

Esistono diversi metodi analitici per rilevare e quantificare AN in un campione. La maggior parte dei metodi disponibili sono fondamentalmente o spettrofotometrica (ad esempio, A ₂₆₀ valori di assorbanza e A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti), fluorimetrica (ad esempio, il legame di tiazolo arancione o altri coloranti fluorescenti a NA), o colorimetrico (suscettibilità di nucleosidi a reazioni chimiche rendimento che cromofori assorbenti in UV-VIS regione dello spettro elettromagnetico), come recentemente descritto da De Mey et al. ¹ Tuttavia, il passo cruciale di identificare il tipo di polinucleotide come RNA o DNA è oltre la portata di molti di questi quantificazione approcci. Qui forniamo una serie di test colorimetrici di individuare rapidamente i tipi di componenti NA in un campione proteico.

I protocolli descritti qui cun essere efficacemente eseguito senza ulteriori fasi di isolare le impurità potenziali NA, e si basano su test Benedetto per zuccheri riducenti ^11, il saggio di orcinol pentosi ^{12,13, 14,15} e reazioni difenilammina di 2'-deoxypentoses (figure 1 e 2) . Test del Benedetto (Figura 2a) utilizza la capacità del lineare, forma a catena aperta (aldeide) di zucchero aldosio ridurre Cu ^{2 +,} con concomitante ossidazione del carbonile zucchero di una porzione carbossilato e produzione di Cu ₂ O come insolubile precipitato rosso. Questa reazione test positivo con libero zuccheri riducenti come aldosi e chetosi (che convertono le aldosi corrispondenti attraverso intermedi enediol), ma non con zuccheri pentosi che sono bloccati in forma ciclica come parte della spina dorsale covalente di un DNA o RNA polinucleotide. A causa del requisito minimalista di una funzionalità senza emiacetale, altri compounds che potrebbero test positivo in questo saggio - e quindi agiscono come potenziali interferenti - sono α-idrossi-chetoni e oligosaccaridi brevi (ad esempio il maltosio disaccaride). Sia il Bial di orcinol (Figura 2b) e Dische di difenilammina (figura 2c) reazioni sono basate sulla distruzione iniziale del backbone polinucleotide, tramite depurination del nucleoside e acido o ulteriore base-catalizzata idrolisi dei nucleotidi madri, per ottenere furan-2 -carbaldehyde (furfurolo) derivati; questi derivati ​​poi reagire sia con un poliidrossi fenolo come orcinol (Bial) o difenilammina (Dische di) reagenti per formare prodotti di condensazione colorate di struttura chimica in gran parte sconosciute. Il DNA RNA rispetto specificità del test del Dische deriva dal fatto che lo zucchero pentoso deve essere 2'-deossigenata per essere suscettibili di ossidazione per ω-hydroxylevulinyl aldeide, che reagisce ulteriormente con difenilamminain condizioni acide per ottenere un blu brillante condensa (figura 2c). Utilizzando i protocolli semplificati descritti qui, abbiamo trovato che queste reazioni colorimetriche zucchero-specifici può distinguere tra RNA e DNA, e indicherà la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio o in un campione biomolecolare.

Protocollo

1. Saggio di Benedetto per la riduzione degli Zuccheri

1. Preparare una quantità adeguata di reattivo di Benedict - 940 carbonato di sodio anidro mM, 588 mM di citrato di sodio diidrato, 68 mM di rame (II) pentaidrato solfato. Questo reagente può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per almeno sei mesi senza alcun cambiamento visibile della reattività.
2. Il reagente sopra è 6x. Così, per 600 reazioni ul, aggiungere 100 ml di reattivo di Benedict per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo (ad esempio, Eppendorf marca), per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione di questo tubo, la quantità ottimale può essere determinata in base all'intensità della formazione di colore in un periodo di prova iniziale. Se il campione disponibile è sufficiente quindi iniziare tali prove al massimo volume del campione possibile (cioè, i cinque sesti del volume di reazione totale, 500 ml di campione in questo caso), e poi diluire in saggi successivi.
4. Aggiungi DDH ₂ O al tuessere quello di portare il volume finale a 600 microlitri, miscelare la soluzione nel vortex o pipettaggio.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita.
9. Azzerare il Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua.
10. Misurare l'assorbanza di questo campione a 475 nm.

2. Assay orcinol Bial per Zuccheri pentosi

1. Preparare una quantità adeguata di reagente Bial fresco - 24,2 mM orcinol monoidrato (vedere la Figura 2b per la struttura di questo composto), HCl 6 M, 0,025% w / v di cloruro ferrico esaidrato Nota.:Per la conservazione prolungata, reagente di Bial possono essere preparate come due soluzioni separate fotografici: (i) reagenti A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O in HCl concentrato] e (ii) Reagente B [422 mM monoidrato orcinol preparata in 95 % etanolo]. Un reagente può essere conservato a temperatura ambiente per sei mesi; B reagente può essere conservato a 4 ° C per un mese, coperto con un foglio di limitare l'esposizione alla luce. Queste soluzioni madri sono miscelate in un 15 (A): 1 (B) v / v rapporto prima dell'uso.
2. Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Bial per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì.
4. Aggiungere DDH ₂ O al tubo per portare il finale del volume a 1,0 ml, mescolare la soluzione nel vortex o pipettaggio.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l'ispezione visiva.
9. Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua e misurare l'assorbanza del campione a 660 nm cuvetta.

3. Dische di test Difenilammina per 2'-deoxypentose Zuccheri

1. Preparare una opportuna quantità di reagente di difenilammina Dische - 60 mM difenilammina, 11 M di acido acetico glaciale, 179 mM di acido solforico, 62% v / v di etanolo. Questo reagente può essere prerispetto in anticipo e conservato a temperatura ambiente in un contenitore scuro, o ricoperto di un foglio, per limitare l'esposizione alla luce. A causa della sensibilità alla luce il reagente non deve essere conservata indefinitamente, anche se in pratica può essere preparato ogni due-tre mesi con nessun cambiamento apparente reattività.
2. Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Dische di un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì.
4. Aggiungere DDH ₂ O al tubo per portare il volume finale di 1,0 ml, miscelare la soluzione con vortex o pipettamento.
5. Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente.
6. Togliere il campione riscaldato dal bagno e allow raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Centrifugare la provetta campione a> 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi.
8. Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l'ispezione visiva.
9. Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l'acqua e misurare l'assorbanza del campione a 600 nm cuvetta.

4. Note sull'utilizzo Ulteriori

1. Le seguenti classi di molecole sono composti di riferimento adatti per reazioni di controllo positivi e negativi per ogni saggio:
   • Benedetto - Positivo = libero ribosio, fruttosio, glucosio, negativo = RNA, DNA, ATP, ecc. (Qualsiasi saccaride manca una funzionalità senza zucchero riducente)
   • Bial I - Positivo = RNA (ad esempio estratto di lievito del panettiere), ribosio, ATP, UMP, negativo = bovina serum (BSA) o qualsiasi altra proteina
   • Dische I - Positivo = DNA (ad esempio timo di vitello); Negativo = RNA, ATP, ecc. (Qualsiasi non-2'-deossigenata nucleotide)
2. Questi saggi sono stati trovati per essere abbastanza resistente ai composti spesso utilizzati nella purificazione della proteina, per esempio, sali comuni come NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, e K ₂ SO ₄ non interferiscono, e le reazioni sembrano generalmente insensibile il contenuto del diluente. Detergenti o agenti caotropici come urea può influenzare la reattività dei saggi se il pH è altamente base; un neutro a pH acido è generalmente più ottimale per la Bial e Dische di saggi a causa della reazione chimica di base (vedi il testo ed i protoni in figura 2b, c). Condizioni di reazione potenzialmente interferenti non ottimali, sospetti, ecc. dovrebbe essere esaminato caso per caso, mediante il controllo positivo e negativo esperimenti wcomposti di riferimento esimo.

Risultati

Risultati sono mostrati in Figura 3 per l'applicazione di tali saggi colorimetrici ai composti di riferimento noti. Rappresentativi dati qualitativi sono indicati per il Benedetto (a), orcinol Bial di (b), e Dische di difenilammina (c) saggi, e le curve standard per questi tre saggi sono illustrati nella Figura 4. In pannelli 3 (ac), i pannelli di sinistra mostra positive / negative esperimenti di controllo utilizzando analiti opportunamente reattivi / non reattivi; questi risultati...

Discussione

I saggi colorimetrici presentati qui offrono un approccio semplice per valutare rapidamente la natura chimica di miscele biomolecolari, come si incontrano quando purificare proteine, RNA o complessi di cellule intere lisato in preparazione per ulteriori studi. Come biologia strutturale persegue assemblee più nativa, come le sfide progressivamente più grandi, come ad esempio l'eterogeneità del campione, sarà posta dai complessi complesse e multi-componente. Supramolecolari sono spesso solo marginalmente sta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente o attrezzature	Fornitore / società	Numero di catalogo	Commenti, note
Sodio carbonato anidro	Fisher Scientific	S263
Sodio citrato diidrato	Sigma	S-4641
Di rame (II) solfato pentaidrato	VWR	VW3312-2
Monoidrato orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrato	VWR	BDH3030
Cloruro ferrico esaidrato	Sigma	F-2877
Difenilammina	Aldrich	112763
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific	A28
Acido solforico	Sigma-Aldrich	258105
Etanolo	Koptec	V1101
Ribosio	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v in H 2 O
L'acido ribonucleico da lievito di birra (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a -20 ° C
Acido desossiribonucleico (sale sodico), da timo di vitello	Sigma	D1501	preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a 4 ° C
			Reagenti, strumentazione e sicurezza Materiali sono elencati nella following tabella nell'ordine in cui appaiono nella sezione Protocollo. Se non specificato diversamente (sopra), tutti i reagenti possono essere conservati a temperatura ambiente e l'illuminazione. Per tutti gli articoli non elencati di seguito (per esempio, provette da microcentrifuga), la marca solita / modello / varietà trovato in un laboratorio biochimico di serie può essere utilizzata (ad esempio, di marca Eppendorf da 1,5 ml microcentrifuga tubi). Standard di provette per microcentrifuga plastica deve essere utilizzato per operazioni che coinvolgono centrifugazione (ad esempio, al materiale particolato sedimenti vicino alla fine di ciascun protocollo). Nessuna particolare materiale è preferibile, purché i tubi possono essere sigillata; le provette di polipropilene tipici presenti nei laboratori di biochimica funziona bene. In termini di problemi di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti, le precauzioni standard di laboratorio (occhiali di sicurezza, cappe) deve essere esercitata nel pre-sbucciatura, lavorare con, e lo smaltimento di soluzioni contenenti concentrato acetico, cloridrico o solforico. Per i reagenti organici come orcinol o diphenylamine, guanti di nitrile sono preferibili al lattice comune (gomma naturale) varietà.