מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Summary

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

Abstract

ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, _260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). ¹ למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, _260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע ² הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים <0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון "טהורות", ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים> 1.5 ^3.

הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A ₂₆₀ / A ₂₈₀ יחסים (~ 0.8 <~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ"א ודנ"א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).

Introduction

הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. ⁴ חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, ^{5, 6} עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent ^7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית - כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו ^8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו ').

קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית ⁹ בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו '., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical - POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ"א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ"ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב ^10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם.

מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, ₂₆₀ ערכי ספיגה _ו260 / A ₂₈₀ ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ"א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. ^{1 עם} זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים.

הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים ^11, assay orcinol לpentoses ^12,13, ותגובות של diphenylamine ^14,15 2'-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu ^{2 +,} עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu ₂ O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו - ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי - כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ"א לעומת רנ"א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2'-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ"א ודנ"א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.

Protocol

1. Assay של בנדיקט להפחתת סוכרים

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט של בנדיקט - קרבונט 940 מ"מ נטול מי נתרן, מייבשי ציטרט הנתרן mM 588, 68 מ"מ נחושת pentahydrate (II) סולפט. ריאגנט זה ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) לפחות שישה חודשים ללא שינוי ניכר בתגובתיות.
2. מגיב לעיל הוא 6x. כך, 600 תגובות μl, להוסיף 100 μl של ריאגנט של בנדיקט לצינור נקי 1.5 מ"ל microcentrifuge (למשל, אפנדורף מותג), לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה; הנפח האופטימלי ניתן לקבוע על סמך העצמה של היווצרות צבע בהרצה ראשונית. אם מדגם מספיק זמין אז להתחיל בניסויים כאלה בנפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חמש שישיות מעוצמת התגובה הכוללת, 500 μl של דגימה במקרה זה), ואז לדלל במבחנים הבאים.
4. הוסף DDH ₂ O לטויהיה להביא את הנפח הסופי עד 600 μl; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי.
9. Blank ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים.
10. מדוד את הספיגה של מדגם זה ב475 ננומטר.

2. Assay Orcinol של יאל לסוכרי פנטוז

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט של יאל הטרי - קריאטין מונוהידראט 24.2 המ"מ orcinol (ראה איור 2b למבנה של תרכובת זו), 6 M HCl, 0.025% hexahydrate כלוריד הברזל w / v הערה.:לאחסון ממושך, המגיב של יאל יכול להיות מוכן כמו שני פתרונות נפרדים מלאי: (i) מגיבים [0.05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O בריכוז HCl] וכן (ii) מגיב monohydrate orcinol B מ"מ [422 הכין ב95 אתנול%]. מגיב יכול להיות מאוחסן בRT במשך שישה חודשים; B המגיב ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד, מכוסה בנייר כדי לצמצם את חשיפת אור. פתרוני מניות אלה מעורבים ב15 (א): 1 (ב) יחס לפני השימוש v / v.
2. מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ"ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של יאל לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל, לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם.
4. הוסף DDH ₂ O לצינור להביא fנפח inal ל 1.0 מ"ל; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית.
9. לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב660 ננומטר.

3. Assay Diphenylamine של Dische לסוכרים 2'-deoxypentose

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט diphenylamine של Dische - 60 המ"מ diphenylamine, חומצה אצטית קרחונית ז 11, חומצה גופרתית 179 מ"מ, 62% v / v אתנול. מגיב זה יכול להיות מראשpared מראש ולאחסן בRT במכל כהה, או מכוסה בנייר כסף, כדי להגביל את החשיפה לאור. בשל רגישות לאור מגיב לא צריך להיות מאוחסן ללא הגבלה זמן, אף שבפועל זה יכול להיות מוכן בכל שנים עד שלושה חודשים, ללא שינוי ניכר בתגובתיות.
2. מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ"ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של Dische לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל, לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם.
4. הוסף DDH ₂ O לצינור להביא נפח הסופי למיליליטר 1.0; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה וallow לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית.
9. לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב 600 ננומטר.

4. הערות שימוש נוספות

1. המחלקות הבאות של מולקולות הן תרכובות התייחסות מתאימות לבקרת תגובות חיוביות ושליליות לכל assay:
   • של בנדיקט - חיובי = החופשי ריבוז, פרוקטוז, גלוקוז; השלילי = רנ"א, דנ"א, ATP, וכו '. (כל saccharide החסר פונקציונלית סוכר הפחתה חינם)
   • יאל של - החיובי = רנ"א (תמצית השמרים של האופה לדוגמה), ריבוז, ה-ATP, UMP; השלילי = השור serאממ אלבומין (BSA) או כל חלבון אחר
   • Dische של - חיובי = DNA (למשל העגל התימוס); שלילי = רנ"א, ATP, וכו '. (כל הלא 2'-deoxygenated נוקלאוטיד)
2. מבחנים אלה נמצאו להיות די גמישים לתרכובות המשמשות לעתים קרובות בטיהור חלבונים: למשל, מלחים נפוצים כגון NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, ו-K ₂ SO ₄ לא התערב, והתגובות מופיעות בדרך כלל אינן מושפעות את התוכן של ממס. חומרי ניקוי או סוכני chaotropic כגון אוריאה עשויים להשפיע על תגובתיות של המבחנים אם pH הוא בסיסי ביותר, וניטראלי לטווח pH חומצי הוא בדרך כלל אופטימלי ביותר למבחנים של Dische יאל של ובגלל כימית התגובה הבסיסית (ראה את הטקסט ואת הפרוטונים באיור 2b, ג). תנאים לא טובים עלולים להיות תגובה, interferents חשוד, וכו '. צריך להיבדק על בסיס מקרה לפי מקרה, תוך שימוש חיובי ושלילי שליטת הניסויים wתרכובות התייחסות ith.

תוצאות

תוצאות מוצגות באיור 3 ליישום מבחנים אלה לcolorimetric תרכובות התייחסות ידועה. מידע איכותי יציג מוצגים ל( ב), והמבחנים של בנדיקט (א), של יאל orcinol של Dische diphenylamine (ג), ועקומות רגילות לשלושת מבחנים אלה מוצגים באיור 4. בלוחות 3 (AC), לוחות השמאל להראות ניסויים שליטים ח...

Discussion

מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב או ציוד	ספק / חברה	מספר קטלוגים	תגובות, הערות
סודיום קרבונט נטול מים	הפישר סיינטיפיק	S263
dihydrate ציטרט הנתרן	סיגמא	S-4641
נחושת (II) pentahydrate סולפט	VWR	VW3312-2
monohydrate Orcinol	סיגמה אולדריץ	O1875
המרוכז HCl	VWR	BDH3030
hexahydrate כלוריד Ferric	סיגמא	F-2877
Diphenylamine	אולדריץ	112763
חומצה אצטית קרחונית	הפישר סיינטיפיק	A28
חומצה גופרתית	סיגמה אולדריץ	258105
אתנול	Koptec	V1101
ריבוז	סיגמא	R-7500	הכנה על 1% w / v בH 2 O
חומצה ריבונוקלאית מהשמרים של האופה (cerevisiae ס)	סיגמא	R6750	הכנה ב 10 מ"ג / מ"ל בH 2 O; חנות ב -20 ° C
חומצה דאוקסיריבונוקלאית (מלח נתרן), מעגל התימוס	סיגמא	D1501	הכנה ב 10 מ"ג / מ"ל בH 2 O; חנות ב 4 ° C
			ריאגנטים, ציוד ובטיחות חומרים מפורטים בfollowing שולחן הסדר בו הם מופיעים בסעיף הפרוטוקול. אלא אם צוין אחר (לעיל), כל ריאגנטים ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר הסביבה ותאורה. עבור כל פריטים שאינו מופיעים ברשימה שלהלן (לדוגמה, צינורות microcentrifuge), היצרן / דגם / מגוון שנמצא במעבדה הביוכימית תקן הרגיל יכול לשמש (למשל, 1.5 צינורות Eppendorf מותג ml microfuge). צינורות פלסטיק סטנדרטיים microfuge אמורים לשמש לפעולות כרוכות בצנטריפוגה (למשל, לחומר חלקיקי משקעים סמכו לסוף כל פרוטוקול). אין חומר מסוים עדיף, כל עוד את הצינורות יכולים להיות אטומים; צינורות פוליפרופילן הטיפוסיים המופיעים במעבדות ביוכימיה לעבוד היטב. במונחים של חששות בטיחות וסילוק פסולת, אמצעי זהירות מעבדה סטנדרטי (משקפי מגן, ברדסי קטר) צריך להיות למימוש בקילוף מראש, עובד עם, והשלכה של פתרונות המכילים אצטית מרוכזים, הידרוכלורית, או חומצות גופרתיות. לחומרים כימיים אורגניים כגון orcinol או diphenylamine, כפפות nitrile עדיפות על מגוון הלטקס המשותף (גומי טבעי).