التيلومير طول ونشاط تيلوميراز؛ A الين واليانغ من الشيخوخة الخلية

Summary

يوصف أسلوبا دقيقا، قصيرة ومتطورة ورخيصة أن يقيم طول التيلومير في الأنسجة والأنواع باستخدام QRT-PCR متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.

Abstract

التيلوميرات يتم تكرار تسلسل الحمض النووي في الطرف ينتهي من الكروموسومات التي هي متنوعة في الطول والبشر يمكن أن تصل إلى طول 15،000 أزواج قاعدة. التيلومير بمثابة آلية السلامة البيولوجية الاستنزاف كروموسوم في كل انقسام الخلايا. في مدة معينة، تصبح التيلوميرات قصيرة جدا للسماح النسخ المتماثل، وهي العملية التي قد تؤدي إلى عدم الاستقرار كروموسوم أو موت الخلية. وينظم طول التيلومير من قبل اثنين من آليات معارضة: الاستنزاف واستطالة. يحدث الاستنزاف كما يقسم كل خلية. في المقابل، هو استطالة التضمين جزئيا من قبل التيلوميراز الانزيم، الذي يضيف تسلسل تكرار لنهايات الكروموسومات. في هذه الطريقة، يمكن تيلوميراز ربما عكس آلية الشيخوخة ويجدد بقاء الخلية. وهذه هي عناصر حاسمة في الحفاظ على حياة الخلية وتستخدم لتقييم الشيخوخة الخلوية. في هذه المخطوطة سنقوم بشرح طريقة دقيقة، قصيرة ومتطورة ورخيصة لتقييم طول التيلومير في أنسجة متعددةق والأنواع. هذا الأسلوب يستفيد من عنصرين رئيسيين، وتكرار جنبا إلى جنب من تسلسل التيلومير وحساسية QRT-PCR للكشف عن أرقام نسخة التفاضلية للعينات التي تم اختبارها. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.

Introduction

التيلوميرات يتم تكرار الحمض النووي مسدوس (TTAGGG) متواليات وجدت في نهايات الكروموسومات. في كل النسخ المتماثل الخلية، يتم تقصير هذه الغايات كروموسوم. إذا أصبحت قصيرة جدا، يمكن الخضوع لاندماج الكروموسومات التيلومير نهاية، إعادة التركيب الشاذة، وتدهور. وهكذا يكفي صيانة طول التيلومير تلعب دورا رئيسيا في استقرار كروموسوم وحماية الخلية ^38. صيانة طول التيلومير هو أيضا حاسمة لجينات عثر عليها بالقرب من نهايات الكروموسومات، منذ تكرار الحمض النووي لا يمكن أن يستمر إلى نهاية جدا من الكروموسومات ^1-2. ونتيجة لذلك، قد منع تقصير التيلومير تحسين الاستقرار الخلية.

وأفادت العديد من الدراسات أن طول التيلومير ويرتبط مع طول العمر للكائن والدولة المريضة، كما هو الحال في سرطان ^3-4، مرض السكري ^5، وأمراض القلب والأوعية الدموية ^6،7. بالإضافة إلى ذلك، وقد ارتبطت التيلوميرات تقصر مع الإجهاد المفرط أونمط الحياة غير الصحي ^8، ربما عن طريق تعزيز الشيخوخة المبكرة للخلايا وفاة ^9. من ناحية أخرى، وقد وجدت بعض الدراسات أنه لا يوجد اختلاف كبير بين طول التيلومير وطول العمر والسن الأمراض ذات الصلة ^{39، 40، 41.}

واحدة من الآليات الفطرية للخلية حماية من تقصير التيلومير هو عن طريق تفعيل الإنزيم تيلوميراز الخاصة الناسخ العكسي (TERT). هذا الانزيم والوحيدات لها، التيلوميراز الحمض النووي الريبي (TERC)، وهو الحمض النووي الريبي غير الترميز، استخدم التيلومير كقالب لإضافة يكرر التيلومير إلى كروموسوم ينتهي ^10. على الرغم من أن النشاط تيلوميراز غائب من عدة أنواع من الخلايا وغيرها من الآليات التي تشارك في صيانة طول التيلومير، ويرتبط زيادة النشاط تيلوميراز مع زيادة طول التيلومير. وقد أنشئت تفعيل تيلوميراز باعتبارها واحدة من الآليات التي تستجيب الخلايا للتلف والتوتر وتجنب الشيخوخة المبكرة والموت. على سبيل المثال، تعد الشركة المصرية للاتصالاتوقد أثبتت lomeres في عدد سكانها اليهود الأشكناز مع استثنائية العمر ^11، وقد تبين أن الطفرات في TERC أو TERT لتساهم في الإصابة بأمراض مميتة ^12، وتنظيم جينية من تيلوميراز وقد تبين أن يكون لها تأثير على الأمراض ذات الصلة سن ال ^13. منذ اكتشافه، وقد اقترح طول التيلومير والعلامات البيولوجية للحالة الصحية في مختلف النماذج الحيوانية، وكذلك في البشر، ولكن هذه الدراسات في وقت مبكر الصعب تكرار على نطاق واسع بسبب الطريقة المستخدمة كانت شاقة وطويلة ومكلفة. في عام 2002 ومواصلة ضبطها في عام 2009، اقترح Cawthon وأظهرت ودقيقة بروتوكول جديد وسريع وبسيط PCR مقرها لتقييم طول التيلومير ومواصلة التحقيق دورها في مختلف جوانب بيولوجيا الخلية، والشيخوخة والمرض ^19.

اختيار طريقة القياس الصحيح التيلومير لدراسة أمر ضروري. حاليا، هناك العديد من الأساليب المستخدمة لقياس طول التيلومير، كل مع تلقاء نفسهامزايا وعيوب. تقليديا، يتم قياس طول التيلومير باستخدام تحليل لطخة الجنوبية من شظايا تقييد محطة (TRFs)، الذي ينطوي على: أ. هضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد أن لا قطع في تكرار التيلومير من أجل الحصول على TRFs، ب. ويتم ذلك وصمة عار الجنوبي من هذه TRFs عن طريق تحديد طول TRF يعني باستخدام مسبار telomeric ^{14، 37.} على الرغم من أن هذا الأسلوب هو درجة عالية من الدقة مع معامل صغيرة من الاختلاف، هو مقياس مباشر، ويمكن أن تكون مفيدة لقياس توزيع طول، تحليل TRF هو أمر مكلف، ويتطلب عمالة كثيفة لا يقل عن 3 ميكروغرام من الحمض النووي. هذا الأسلوب هو أيضا حساسة للالتيلوميرات قصيرة والتصميم يمكن أن يكون طول مرتبك بواسطة الحمض النووي subtelomeric، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة لجنة التحقيق بسبب هذا (TTAGGG) ن مثل متواليات أنها تحتوي على ^{15، 42.}

آخر طريقة دقيقة للغاية في قياس طول التيلومير واحد التيلومير الاستطالة تحليل طول (STELA)، وهو سينغله جزيء PCR الأسلوب على أساس أن يتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي. في هذه الطريقة، يتم إجراء الاشعال الاعتراف عبء G الغنية في نهاية الصبغيات (الكروموسومات) وربط تسلسل subtelomeric فريدة من نوعها على كروموسوم واحد، مما يزيد من التيلومير كروموسوم معين. التضخيم الناتج ثم تصور من قبل جنوب لطخة. هذا الأسلوب له ميزة كونها دقيقة للغاية وغير قادرة على الكشف التيلوميرات قصيرة النموذجية ^16. للأسف، منذ ليس كل الكروموسومات يكون إنتهاء G الغنية وتسلسل subtelomeric صالحة للاستعمال، لا يمكن إلا أن يقاس طول التيلومير على الكروموسومات محددة، وربما لا تمثل هذه القياسات طول التيلوميرات في كل خلية ^15.

طريقة أخرى التي مورست هو استخدام حمض النووي الببتيد (PNA) تحقيقات للكشف عن طول التيلومير. التنوير الكمي في الموقع التهجين (Q-FISH) يتيح لنا أن تصور التيلوميرات خلال الطورية، حيث القديسaining من التيلوميرات مع التحقيق الذي تجريه السلطة الوطنية الفلسطينية بما يتناسب مع حجمها يسمح للمقارنة بين التيلوميرات الكروموسومات محددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا للخلايا في الطور البيني، وهنا طول التيلومير لالكروموسومات واضحة لا يمكن الكشف، الأمر الذي يضفي وجود قيود عند قياس طول التيلومير في خلايا هرمة أو تقسيم نادرا ^17. FISH تدفق بدلا من ذلك يستخدم التدفق الخلوي ويشغل حاليا منصب الأسلوب الأكثر حساسية لقياس طول التيلومير من خلايا الدم في إعداد سريرية، ولكن يتطلب الفنيين ذوي المهارات العالية ^18.

حاليا، الطريقة المعيارية لقياس متوسط ​​طول التيلومير في المختبر لدينا يستفيد من الدقة والحساسية، وسهولة الكمية في الوقت الحقيقي PCR. وقدم هذه الطريقة ممكنة لقياس طول التيلومير من خلال تطوير الاشعال الرواية التي تجنب تركيب التمهيدي المنتجات ديمر المشتقة، والتي كانت على خلاف ذلك كما تم إنتاجها فيمقايسة نظرا لطبيعة تكرار التيلوميرات tandard. لهذا الاختبار، يتم تمثيل قياس طول التيلومير من قبل T / S نسبة، التيلومير في عدد النسخ تكرار لعدد الجينات نسخة واحدة. لأنه ليس هناك علاقة طردية مباشرة بين طول التيلومير وعدد من المشارع التيلومير المسمى ملزم على الحمض النووي خلال المراحل الأولى من PCR، نسبة T / S يتناسب طرديا مع طول التيلومير. يتم قياس نسبة T / S بمقارنة الفرق في التصوير المقطعي، وعدد دورة كسري الذي المتراكم العينة الإزهار يعبر عتبة هذا هو عدة انحرافات معيارية فوق الإزهار خط الأساس، بين العينات مع الاشعال التيلومير وSCG الاشعال ^19. وقد انتقدت هذه الطريقة لقياس غير المباشرة من طول شريط الحامض النووي، الذي يمكن أن يؤدي إلى قياسات غير دقيقة، على سبيل المثال، في حالة من الازدواجية كروموسوم أو الاختلافات في عدد النسخ ^15. أيضا، المقارنة بين الدراسات في كثير من الأحيان ديوقد وضعت fficult، ولكن معيار الأوليغومرات لقياس طول التيلومير المطلقة ^20. وقد تم تعزيز هذه الطريقة تحسن عليها Cawthon، وذلك باستخدام أحادية اللون متعددة مقايسة QPCR. في هذا الاختبار، تم تشغيل PCR في درجات حرارة منخفضة للدورات القليلة الأولى لتجنب ملزم التمهيدي-ديمر وتم تحليل التيلومير والتحكم الجيني في نفس أنبوب PCR لمزيد من تجنب الخطأ. الناتجة قياسات طول التيلومير مرتبطة ارتباطا قويا مع طول التيلومير تقاس تحليل لطخة الجنوبية من TRFs وكان أعلى دقة ^{15 و 19 و 36.} في هذه اللحظة، QRT-PCR هو الأسلوب الوحيد المتاح مريحة لاختبار أحجام عينة كبيرة ويتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي للقيام بها. جزء حاسم من هذا الأسلوب هو اتخاذ تدابير شاملة لمراقبة الجودة، بحيث عندما يكون القيام به بشكل صحيح، وهذه الطريقة يمكن أن توفر معلومات مقارنة قيمة عن طول التيلومير. بالإضافة إلى ذلك، قد تم تكييف هذه الطريقة للاستخدام خارج الكريات البيض لقياس طول التيلومير في مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة ^42.

بالإضافة إلى ذلك، من أجل مزيد من فهم البيولوجيا وراء صيانة طول التيلومير والتفاعلات بين اثنين من آثار معارضة (أي تقصير التيلومير أثناء النسخ المتماثل واستطالة بواسطة انزيم تيلوميراز)، ونحن رافق طريقة طول التيلومير مع فحص إضافي الذي يقيس النشاط تيلوميراز.

لهذا الغرض، استخدمنا Telomeric بروتوكول التضخيم كرر، وهو فحص في المختبر. لفترة وجيزة، هي lysed، والحفاظ عليها، وخلايا نشطة إنزيمي توليفها يكرر telomeric على ركيزة قليل النوكليوتيد باستخدام تيلوميراز، وتم تضخيم PCR المنتجات التي تستخدم في وجود SYBR الأخضر. ثم تم تحليل النتائج من خلال مقارنة العينة وسيطرة القيم عتبة ط. منذ تيلوميراز هو انزيم حساسة للحرارة، يتم تشغيل حرارة إضافية تعامل التحكم جنبا إلى جنب مع كل عينة ^21.

هناك حاجة إلى "jove_content"> بينما قياس طول التيلومير يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الدور الذي يمكن أن طول التيلومير في الفيزيولوجيا المرضية من الشيخوخة والمرض، وطول التيلومير هو ليس خاصية ثابتة ومزيد من المعلومات لفهم وظيفة التيلومير. يمكن أن دراسات النشاط تيلوميراز إضافة معلومات حول آليات تنظيم طول التيلومير. على سبيل المثال، يمكن تفعيل رقابة من تيلوميراز الحفاظ على طول التيلومير وتكاثر الخلايا، ولكن التنشيط غير المنضبط للتيلوميراز يمكن أن يؤدي إلى السرطان. هذه الأساليب إلى الأمام مباشرة وغير مكلفة والجمع بين اثنين وفرت لنا ليس فقط مع أدلة أقوى نحو علاقة بين طول التيلومير والاستقرار الخلية، ولكن أيضا مزيد من التبصر في الآليات الممكنة من تقصير التيلومير والانتعاش. مع هذه الأساليب ونأمل في مزيد من توضيح استجابة الخلية إلى الشيخوخة ومختلف الدول من انتشار الخلايا مع الهدف النهائي المتمثل في التوصل إلى فهم أفضل للوسط mechanisMS بيولوجيا الخلية.

Protocol

1. التيلومير بروتوكول طول ¹⁹

1. عزل الحمض النووي

يمكن استخدام معظم وسائل عزل الحمض النووي. مختبرنا يفضل QIAGEN DNeasy كيت (# 69506) عن مصادر في الدم. اعتمادا على مصدر من الحمض النووي، مثل مصادر الشدق أو غيرها، ويمكن استخدام طريقة العزل المختلفة.

2. الاشعال:

مخففة جميع الاشعال إلى تركيز الأسهم من 100pmoles/μl في PCR المياه الصف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة. مصنوعة مخزونات عمل الاشعال الطازجة ويتم تخزينها عند 20 درجة مئوية لفترة قصيرة من الوقت (بضعة أشهر). استخدمت الاشعال القياسية لالتيلوميرات وβ غلوبين، وSCG، كما هو موضح في أوكاالهان وآخرون. ²⁰ .

تسلسل التمهيدي:
TELO 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

TELO 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

ملاحظة: يتم تخفيفه الاشعال إلى تركيز العمل من 10pmoles/μl، قبل إضافة إلى مزيج التفاعل.

3. التخفيف المسلسل من الحمض النووي الجيني:

يتم إنشاء التخفيفات المسلسل من الحمض النووي الجيني لTELO واحدة نسخ الجينات (SCG) لإنشاء منحنى قيمة ط م القياسية للمقايسة. تم استخراج الحمض النووي الجيني المستخدمة من الخلايا الليمفاوية من عينات الدم. يتم إنشاء هذه التخفيفات عن طريق تمييع DNA PCR مع الصف H ₂ 0 إلى كل تركيز من قبل عامل من 1.68 إلى تسفر عن مجموعتين من التخفيفات المتسلسلة باستخدام نفس الحمض النووي الجيني. وقد تم تحسين تركيزات بدءا يعتمد على التجربة والخطأ، وربما تحتاج إلى تعديل عند استخدام الكواشف المختلفة، والصكوك، الحمض النووي من الأنواع الأخرى، أنواع الخلايا، وSCG المستخدمة.

ملاحظة: يتم إجراء التخفيف المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني عن طريق خلط بلطف والانتظار على الأقل 15 دقيقة إلى ساعة واحدة befoإعادة أخذ الحمض النووي لتخفيف المقبل. كل تخفيف يتطلب وقتا لفصل الحمض النووي الجيني ل. للتخزين، قسامة التخفيفات المتسلسلة على المدى الطويل إلى شرائح PCR للتخزين في -80 درجة مئوية. يتم إذابة كل قطاع PCR وتستخدم مرة واحدة لتجنب ذوبان تجميد دورات التي قد تؤدي إلى تلف الحمض النووي.

4. إعداد رد فعل لRT-PCR

الأداة المستخدمة: Roche480 ضوء Cycler

الكاشف: روش ضوء cycler SYBR الخضراء

تمييع عينات من الحمض النووي اختبار لتركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر. نحن اختبار تركيز باستخدام معمل NanoDrop أو و qubit. نحن تمييع مزيد من الحمض النووي من 10ng/μl إلى 5ng/μl النهائي. نحن لا اختبار تركيز مرة أخرى.

مكونات التفاعل:

TELO	1X		SCG	1X
H 2 0	6 ميكرولتر		H20	6 ميكرولتر
TELO 1	0.2 ميكرولتر		SCG 1	0.6 ميكرولتر
TELO 2	1.8 ميكرولتر		SCG 2	1.4 ميكرولتر
RXN مزيج	10 ميكرولتر		RXN مزيج	10 ميكرولتر
الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل	2 ميكرولتر		الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل	2 ميكرولتر

ملاحظة: يرصد ماستر مزيج من دون الحمض النووي ومع وجود فائض من 5٪ إلى 10٪.

يتم تشغيل كلا TELO وSCG معا على نفس لوحة باستخدام البرنامج التالي. لاختبار دقة، على الأقل ثلاث مكررات من كل عينة ويجب تشغيل التحكم. الاختلافات في الاشعال المستخدمة قد يؤثر على النتائج. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للعمل على النحو التالي على Roche480 ضوء Cycler والاشعال لدينا.

فيتفسد itial
10 دقيقة تفسد 95 ° C
ركوب الدراجات
95 ° C 10 عقد ثوانى
60 ° C 5 ثوانى الانتظار
72 ° C 11 ثوانى الانتظار واقتناء واحد
تكرار 45-55 مرات كما هو مطلوب

2. كشف تيلوميراز الكمي (QTD) بروتوكول (بناء على عدة QTD من قبل الحلفاء في مجال التكنولوجيا الحيوية، وشركة كات. رقم MT3012)

استخراج التحضير

1. بيليه الخلايا أو الأنسجة.
2. يغسل مرة واحدة مع 1X PBS.
3. Repellet وإزالة 1X PBS. *
4. Resuspend وبيليه الخلية في 200 ميكرولتر من 1 × الاحتياطي تحلل لكل 10 ⁵ -10 ⁶ خلايا أو 40-100 ملغ من الأنسجة.
5. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
6. تدور باستمرار العينة في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
7. نقل 160 ميكرولتر من طاف في أنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين.
8. قسامة وسريعة تجميد استخراج المتبقية على الثلج الجاف / الإيثانول، مخزن في -80 درجة مئوية.

* في رحالته، تيلوميراز في الخلايا أو الأنسجة المجمدة ثابت لمدة سنة على الأقل. عندما إذابة للاستخدام، resuspend الخلايا مباشرة في 1 × الاحتياطي تحلل.

2.1. تحكم مقايسة

التحكم تعطيل الحرارة: لكل عينة، تسخين علاج مستخرج تحكم إضافية التي يحتضنها في 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل تيلوميراز فحص النشاط.

منحنى القياسية لقالب التحكم TSR: إجراء الكمي في الوقت الحقيقي PCR باستخدام التخفيفات من TSR، وهو قليل النوكليوتيد مع تسلسل مماثلة لالاشعال التيلومير المتضمنة عدة لتوليد منحنى القياسية.

1. إعداد 1:05 التخفيفات التسلسلي للتركيز TSR الأسهم (0.5 amoles / ميكرولتر) مع العازلة تحلل
2. إجراء كشف فحص مستوى تيلوميراز باستخدام 1 ميكرولتر من كل تخفيف TSR، بما في ذلك تركيز الأسهم. ويمكن تخزين هذه التخفيفات في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل.

2.2. تيلوميراز نشاط الفحصباستخدام QTD في الوقت الحقيقي PCR

1. لكل عينة، إضافة ما يلي إلى أنبوب PCR أو رقيقة الجدار لوحة PCR (إجمالي حجم 25.0 ميكرولتر):
   • 12.5 ميكرولتر من 2 بريمكس QTD X
   • 1.0 ميكرولتر من الخلايا أو الأنسجة استخراج
   • 11.5 ميكرولتر من PCR المياه مؤهل
2. تخلط جيدا
3. برنامج في الوقت الحقيقي أنظمة كشف PCR وفقا للبرنامج التالي:
   - 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (رد فعل تيلوميراز)
   - 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (PCR خطوة التنشيط الأولي)
   35-40 دورات:
   - 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تمسخ)
   - 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (الصلب)
   - 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (ملحق)
4. وضع أنابيب PCR في cycler الحرارية وبدء برنامج ركوب الدراجات.
5. جمع دورة عتبة أو C _T قيمة بعد الانتهاء من الدورات. دورة عتبة هو دورة في التي تم الكشف عنها زيادة ذات دلالة إحصائية من ΔRn الأول.

2.3. تحليل البيانات

1. Generatعصام منحنى قياسي باستخدام _T قراءات C والمقارنة النشاط تيلوميراز.

النتائج

ويرد مثال على طول التيلومير QRT-PCR مقايسة في الشكل 1. على لوحة أعلى اليسار، وعينات صفت باللون الأحمر والأخضر يمثل الموقع من الموضوعات اختبارها على لوحة 96 جيدا. على لوحة أعلى اليمين، ويتجلى منحنى التضخيم. يتم اختبار كل مادة من قبل اثنين من المقايسات (التيلومير و?...

Discussion

يوفر طول التيلومير علامة الخلوية فريدة لدراسة الخلية وشدد والشيخوخة، ويقدم نظرة ثاقبة لآليات الشيخوخة. منذ دورها في الشيخوخة قد اقترح أولا، وقد تم القيام به العديد من الدراسات المتعلقة طول التيلومير إلى العمر، طول العمر، الأمراض المرتبطة بالعمر، وأمراض السرطان، و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516