텔로미어의 길이와 텔로 머라 제 활성을 세포 노화의 음과 양

요약

정확하고, 짧은 정교하고 저렴한 방법은 여러 조직과 QRT-PCR을 사용하여 종 텔로미어 길이를 평가하는 것을 설명합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

초록

텔로미어는 끝에 DNA 시퀀스를 반복하는 것은 길이와 인간의 다양 염색체의 15,000 염기쌍의 길이에 도달 할 수 끝난다. 텔로미어 (telomere)는 각각의 세포 분열에서 염색체 감소의 바이오 보호용 장치 역할을합니다. 특정 길이에서 텔로미어 복제, 염색체 불안정성 또는 세포 사망을 초래할 수있는 프로세스를 허용하기에 너무 짧은된다. 감소 및 신장 : 텔로미어 길이는 두 개의 반대 메커니즘에 의해 조절된다. 각 셀 분할과 마찰이 발생합니다. 대조적으로, 신장은 염색체의 끝 부분에 반복 시퀀스를 추가하는 효소 telomerase에 의해 부분적으로 변조됩니다. 이러한 방법으로, 텔로 머라 가능성이 노화 메커니즘을 반대로 세포 생존을 젊어지게 할 수 있습니다. 이 세포의 수명을 유지하는 중요한 요소이며, 세포의 노화를 평가하는 데 사용됩니다. 이 논문에서 우리는 여러 조직의 텔로미어 길이를 평가하는 정확하고 짧은 정교하고 저렴한 방법을 설명합니다의 종. 이 방법은 텔로미어 시퀀스의 탠덤 반복 및 테스트 샘플의 차이 사본 번호를 검색하는 QRT-PCR의 민감도, 두 가지 핵심 요소로 활용합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

서문

텔로미어는 염색체의 끝 부분에서 발견 DNA hexamer (TTAGGG) 시퀀스를 반복합니다. 각 세포 복제, 이러한 염색체 끝이 단축됩니다. 그들은 너무 짧은 될 경우, 염색체 telomere의 끝 융합, 탈선 재조합 및 저하를 겪을 수 있습니다. 따라서 충분한 텔로미어 길이를 유지 염색체의 안정성 및 세포 보호 ^38에있는 중요한 역할을한다. 텔로미어 길이를 유지 보수는 염색체의 끝 근처에서 발견 유전자 중요하다, 이후 DNA 복제는 염색체 ^1-2 끝까지 계속할 수 없습니다. 결과적으로, 텔로미어 단축 방지 세포의 안정성을 향상시킬 수 있습니다.

많은 연구는 telomere의 길이가 같은 ^3-4, 당뇨병 ⁵ 및 심혈관 질환 ^6,7 암과 같은 유기체의 수명과 질병 상태와 상관 관계가 있다고보고있다. 또한, 단축 telomeres는 과도한 스트레스와 관련되어아마도 조기 세포 노화와 죽음 ^9을 촉진하여 건강에 해로운 생활 습관 ^8. 반면에, 일부 연구는 질병 ^{39, 40, 41 관련} 텔로미어 길이와 수명과 연령간에 유의 한 차이가없는 것으로 나타났습니다.

텔로미어 단축에서 보호 세포의 타고난 메커니즘 중 하나는 자신의 효소 telomerase의 역전사 효소 (TERT)을 활성화하는 것입니다. 이 효소의 소단위, telomerase의 RNA (TERC), 비 코딩 RNA는 ¹⁰ 종료 염색체 telomere의 반복을 추가하는 템플릿으로 텔로미어 (telomere)를 사용합니다. 텔로 머라 제 활성이 세포와 다른 메커니즘의 여러 유형의 텔로미어 길이를 유지 보수에 관련된 결석이지만, 증가 텔로 머라 제 활성이 증가 텔로미어의 길이와 상관된다. telomerase의 활성화는 세포 손상에 대응하고 스트레스 및 조기 노화와 죽음을 방지하는 메커니즘 중 하나로서 설립되었습니다. 예를 들어, 더 이상 테lomeres이 뛰어난 수명 ^11와 아시 케 나지 유대인의 인구에 설명 된, TERC 혹은 TERT의 변이는 연령과 관련된 질병 ^13에 영향을 보여왔다 치명적인 질병 ^12와 텔로 머라 제의 성적인 조절에 기여하는 것으로 알려져있다. 그것의 발견부터, 텔로미어 길이는 다양한 동물 모델에서뿐만 아니라 인간의 건강 상태에 대한 바이오 마커로 제시하지만, 사용 방법, 지루한 긴과 비용 때문에 이러한 초기 연구는 널리 복제 할 어려웠다되었습니다. 2002 년 더 2009 년 조정에서 Cawthon는 제안 텔로미어 길이를 평가하고 더 노화와 질병 ^19, 세포 생물학의 다양한 측면에서의 역할을 조사하는 새로운, 정확하고, 빠르고 간단한 PCR 기반 프로토콜을 보여 주었다.

연구에 대한 올바른 telomere의 측정 방법을 선택하는 것은 필수적이다. 현재 텔로미어 길이를 측정하는 데 사용되는 다양한 방법 자체에 각각있다장점과 단점. 을 : 전통적으로, 텔로미어 길이는 포함 터미널 제한 조각 남부 얼룩 분석 (TRFs)를 사용하여 측정됩니다. B, TRFs를 얻기 위해 telomere의 반복에서 잘라하지 않는 제한 효소로 DNA를 소화. 이 TRFs 남부 오점은 말단 소립 프로브 ^{14, 37를} 사용하여 평균 TRF의 길이를 결정하여 수행됩니다. 이 방법은 변화의 작은 계수가 매우 정확하지만, 직접 측정, 길이 분포를 측정하기위한 유리한 수 있습니다, TRF 분석은 노동 집약적 비용과 DNA의 최소 3 μg을 필요로합니다. 이 방법은 프로브로 인해 (TTAGGG) N ^{그들이 42 15를} 포함하는 시퀀스와 같은 감지 할 수 탐지되었다 DNA에 의해 혼동 될 수도 짧은 텔로미어 길이 결정에 구분하지 않습니다.

텔로미어 길이를 측정하는 또 다른 매우 정확한 방법은 단일 Telomere는 연신율 길이 분석 (STELA), Singl에 있습니다단지 DNA의 작은 금액을 필요로 전자 분자 PCR 기반 방법. 이 방법에서는, 프라이머는 염색체의 끝 부분에 G 풍부한 물량을 인식하고 특정 염색체의 텔로미어 (telomere)를 증폭 한 염색체에 독특한 탐지되었다 시퀀스에 바인딩 만들어집니다. 결과적으로 증폭 한 후 남부 오점으로 시각화됩니다. 이 방법은 매우 정확하다는 장점을 가지고 있으며, 짧은 국외자 텔로미어에게 ^16를 감지 할 수 있습니다. 모든 염색체 G 풍부한 끝을 가지고 사용할 수있는 탐지되었다 순서 때문에 불행하게도, 텔로미어 길이는 특정 염색체에서 측정 할 수 있으며 이러한 측정은 세포 ^15의 모든 텔로미어의 길이를 표시하지 않을 수 있습니다.

연습을했습니다 또 다른 방법은 telomere의 길이를 감지하는 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 사용하는 것입니다. 현장 하이브리드 화 양적 형광 (Q-FISH)는 우리가 성 중기, 동안 텔로미어를 시각화 할 수 있습니다의 크기에 비례하여 PNA 프로브와 텔로미어의 aining은 특정 염색체 사이의 텔로미어의 비교를 허용합니다. 이 방법은 또한 계면에서 셀에 사용할 수 있지만, 여기에 서로 다른 염색체의 텔로미어 길이는 ¹⁷ 노화 또는 자주 분열 세포에서 텔로미어 길이를 측정 할 때 제한을 도입하는 감지 할 수 없습니다. 흐름이 물고기 대신 유동 세포 계측법을 사용하여 현재 임상에서 혈액 세포의 텔로미어 길이를 측정하는 가장 민감한 방법이지만, 고도로 숙련 된 기술자가 ^18이 필요합니다.

현재, 우리 실험실에서 평균 telomere의 길이를 측정하기위한 표준 방법은 정밀도, 감도의 활용 및 정량 실시간 PCR의 용이성. 이 메소드는, 그렇지 않으면로 제작했을 프라이머 이합체 파생 제품의 합성을 방지 소설 프라이머의 개발로 텔로미어 길이를 측정 가능하게되었다텔로미어의 반복 특성으로 인해 tandard 분석. 이 분석을 위해, 텔로미어 길이의 측정은 단일 사본 유전자 수에 T / S 비율, telomere의 반복 사본 번호가 표시됩니다. 텔로미어 길이와 PCR의 시작 단계에서 DNA에 바인딩 표시 텔로미어 프라이머의 수 사이에 직접적인 비례 관계가 있기 때문에, T / S 비율은 telomere의 길이에 정비례한다. T / S 비율 코네티컷에있는 차이를 비교하여 측정, 시료가 형광을 축적 된되는 부분 사이클 수는 텔로미어 프라이머 샘플 및 프라이머 ¹⁹ SCG 사이의 기본 개화 위의 몇 가지 표준 편차 인 임계 값을 교차합니다. 이 방법은 염색체 중복 또는 복사 번호 편차 ^15의 경우 부정확 한 측정으로 이어질 수있는 텔로미어의 길이는 간접 측정, 예를 들어 비판하고있다. 또한, 연구의 비교는 종종 디입니다fficult하지만, 표준 올리고머는 절대 텔로미어 길이 ^20를 측정하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 흑백 멀티 플렉스의 qPCR 분석을 사용하여 Cawthon에 따라 개선 발전한되었다. 이 분석에서는 PCR은 프라이머 이합체 바인딩을 방지하기 위해 처음 몇주기 낮은 온도에서 실행되고 텔로미어 및 제어 유전자는 더 이상 오류를 방지하기 위해 동일한 PCR 튜브에서 분석 하였다. 결과 텔로미어 길이를 측정 강하게 TRFs 남부 blot 분석에 의해 측정 텔로미어의 길이와 상관 더 높은 정확도를 ^{15, 19, 36을했다.} 순간, QRT-PCR 큰 샘플 크기를 테스트 사용할 수있는 유일한 편리한 방법입니다 만 수행하는 DNA의 작은 금액을 필요로합니다. 이 방법의 중요한 부분이 제대로 끝나면,이 메소드는 텔로미어의 길이에 대한 유용한 비교 정보를 제공 할 수 있도록 포괄적 인 품질 관리 대책이다. 또한이 방법은 측정 백혈구 이상 사용하기 위해 적응했다다른 조직의 다양한 ⁴² telomere의 길이입니다.

또한, 더 텔로미어 길이를 유지 보수하고 두 반대 효과 (텔로 머라 제 효소에 의해 복제 및 신장 동안 즉, 텔로미어 단축) 사이의 상호 작용의 뒤에 생물학을 이해하기 위하여, 우리는 텔로 머라 제 활성을 측정 추가적인 분석과 텔로미어 길이 방법을 함께.

이 목적을 위해, 우리는 말단 소립 반복 증폭 프로토콜, 체외 분석을 사용 하였다. 간단히, 용해, 보존, 효소 활성 세포는 텔로 머라 제를 사용하여 올리고 뉴클레오티드 기판 상에 말단 소립 반복을 합성하고, 제품은 SYBR 녹색의 면전에서 PCR을 이용하여 증폭 하였다. 결과는 샘플을 비교하고 제어 코네티컷 임계 값에 의해 분석 하였다. 텔로 머라 제는 열에 민감한 효소이기 때문에, 추가적인 열 제어 처리는 각 시료 ^21와 함께 실행됩니다.

텔로미어 길이를 측정하는 것이 노화와 질병의 병태 생리에서 텔로미어 길이의 가능한 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 텔로미어 길이는 정적 속성 및 자세한 내용은 아니다는 telomere의 기능을 이해하기 위해 필요합니다. 텔로 머라 제 활성 연구는 텔로미어 길이 조절 메커니즘에 대한 정보를 추가 할 수 있습니다. 예를 들어, 텔로 머라 제의 제어 활성화는 텔로미어 길이와 세포 증식을 유지할 수 있지만, 텔로 머라 제의 억제되지 않는 활성화는 암이 발생할 수 있습니다. 결합이 두 저렴하고 곧장 앞으로 방법은 텔로미어 길이와 세포의 안정성 사이의 관계를 향해 강력한 증거뿐만 아니라, 텔로미어 단축과 복구의 가능한 메커니즘에 대한 자세한 통찰력뿐만 아니라 우리를 제공했습니다. 이러한 방법으로 우리는 더 이상 중앙 mechanis의 더 나은 이해의 궁극적 인 목표로 노화 및 세포 증식의 다양한 상태에 대한 세포의 반응을 명료하게 희망세포 생물학 석사.

프로토콜

1. 텔로미어 길이 프로토콜 ¹⁹

1. DNA 분리

대부분의 DNA 분리 방법을 사용할 수 있습니다. 우리 실험실은 혈액 소스에 Qiagen의 DNeasy의 키트 (# 69506)를 선호한다. 같은 구강이나 다른 소스로 DNA의 소스에 따라 다른 분리 방법을 사용할 수 있습니다.

2. 프라이머 :

모든 프라이머는 PCR 등급 물 100pmoles/μl의 재고 농도로 희석하고 필요한 때까지 -20 ° C에 저장됩니다. 프라이머 작업 주식은 시간의 짧은 기간 동안 신선한 만들어 20 ° C에 저장됩니다 (몇 개월). 표준 프라이머로 켈라 등의 설명, 텔로미어와 β-글로빈, SCG 사용 하였다. ²⁰ .

프라이머 시퀀스 :
Telo 1 : 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2 : 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1 : 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2 : 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

참고 : 프라이머가 이전의 반응 믹스에 추가로 10pmoles/μl의 작업 농도로 희석한다.

3. 게놈 DNA 용액을 희석 :

Telo 및 단일 복사본 유전자 (SCG)에 대한 게놈 DNA의 시리얼 희석 분석에 대한 표준의 CT 값 곡선을 생성하기 위해 만들어집니다. 사용 된 게놈 DNA는 혈액 샘플에서 림프구로부터 추출 하였다. 이 희석은 동일한 게놈 DNA를 사용하여 시리얼 희석의 두 세트를 산출하기 위해 1.68의 계수로 각 농도 PCR 등급 H ₂ 0과 DNA를 희석하여 만들어집니다. 시작 농도는 시행 착오를 기반으로 최적화 된 다른 시약, 계기, 다른 종의 DNA, 세포 유형, 사용 SCG를 사용할 때 조정해야 할 수 있습니다.

참고 : 게놈 DNA를 사용하여 시리얼 희석 부드럽게 혼합 한 시간 befo의 적어도 15 분을 대기에 의해 만들어진다음 희석 DNA를 가지고 다시. 각 희석 해리하는 게놈 DNA의 시간이 필요합니다. -80에서 보관 PCR 스트립 ° C.에 장기 보관, 나누어지는 일련 희석에 대한 각 PCR 스트립 해동 DNA를 손상시킬 수 있습니다 동결 융해를 방지하기 위해 한 번 사용됩니다.

4. RT-PCR에 대한 반응 설정

사용 악기 : Roche480 라이트 자전거 타는 사람

시약 : 로슈 라이트 자전거 타는 SYBR 녹색

10 NG / μL의 최종 농도에 테스트 DNA 샘플을 희석. 우리는 Nanodrop 분광 또는 큐 비트를 사용하여 농도를 테스트합니다. 우리는 더 10ng/μl에서 최종 5ng​​/μl에 DNA를 희석. 우리는 다시 집중력을 테스트하지 않습니다.

반응 구성 요소 :

TELO	1X		SCG	1X
H 2 0	6 μL		H20	6 μL
Telo 1	0.2 μL		1 SCG	0.6 μL
Telo 2	1.8 μL		2 SCG	1.4 μL
RXN 혼합	10 μL		RXN 혼합	10 μL
DNA 또는 직렬 희석	2 μL		DNA 또는 직렬 희석	2 μL

참고 : 마스터 믹스는 DNA없이 5 % ~ 10 %의 초과로 구성되어 있습니다.

Telo와 SCG는 모두 다음과 같은 프로그램을 사용하여 동일한 접시에 함께 실행됩니다. , 정밀 테스트하기 위해 세 이상에서 각 샘플의 복제 및 제어를 실행해야합니다. 사용되는 프라이머의 변화는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 Roche480 라이트 자전거 타는 우리 프라이머에 다음과 같이 작동하도록 최적화되었습니다.

에itial 변성
10 분 변성 95 ° C
사이클링
95 ° C 10 초 홀드
60 ° C 5 초 홀드
72 ° C 11 초 대기 및 단일 수집
필요에 따라 45-55 회 반복

2. 정량적 인 텔로 머라 제 검출 (QTD) 프로토콜 (연합 생명 공학, 주식 회사 고양이. 번호 MT3012에 의해 QTD 장비 기준)

준비를 추출

1. 펠렛 세포 나 조직.
2. 1X PBS로 한 번 씻으십시오.
3. Repellet 및 제거 1X PBS. *
4. 매 10 ⁵ -10 ⁶ 세포 나 조직의 40-100 MG를위한 1 개의 x 용해 완충액 200 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend.
5. 30 분 동안 얼음에 품어.
6. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 스핀 다운
7. 새로운 튜브에 뜨는 160 μl를 전송하고 단백질 농도를 결정한다.
8. 나누어지는 및 -80 드라이 아이스 / 에탄올에 대한 빠른 동결 나머지 추출물, 저장 ° C.

* T에서그의 조건은 냉동 세포 또는 조직에서 텔로 머라 제는 적어도 년 동안 안정적입니다. 사용 해동 할 때, 1 개의 x 용해 버퍼에 즉시 세포를 resuspend을.

2.1. 분석 제어

열 비활성화 제어 : 각 샘플의 경우, 이전의 텔로 머라 제 활성 분석에 10 분 동안 85 ° C에서 배양하여 추가 제어 추출물을 치료 가열한다.

TSR 컨트롤 템플릿에 대한 표준 곡선 : 표준 곡선을 생성하기 위해 키트에 포함 된 텔로미어 (telomere) 프라이머와 유사한 시퀀스 TSR, 올리고 뉴클레오티드의 희석을 사용하여 정량 실시간 PCR을 수행합니다.

1. 용해 버퍼 주식 TSR의 농도 1시 5분 시리얼 희석 (0.5 amoles / μL)를 준비
2. 주식 농도를 포함하여 각 TSR 희석 1 μL를 사용하여 telomerase의 검출 기준 분석을 수행합니다. 이 희석은 최소 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2.2. telomerase의 활동 분석QTD 실시간 PCR을 사용하여

1. 각 샘플은 PCR 튜브 얇은 벽 PCR 플레이트 (총 부피 25.0 μL)에 다음을 추가합니다 :
   • 2 개 QTD 섞은 12.5 μL
   • 세포 나 조직 추출물의 1.0 μL
   • PCR 자격을 갖춘 워터의 11.5 μL
2. 잘 혼합
3. 아래의 프로그램에 따라 프로그램을 실시간 PCR 탐지 시스템 :
   - 25 ° C 20 분 (telomerase의 반응)에 대한
   - 95 10 분 (PCR 초기 활성화 단계)에 대한 ° C
   의 35-40주기 :
   - 95 ° C 30 초 (변성)
   - 60 ° C 30 초 (어닐링)
   - 72 ° C 30 초 (연장)
4. 열 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 순환 프로그램을 시작합니다.
5. 사이클 완료 후 임계 사이클 또는 C _{T 값을} 수집합니다. 임계 값주기 ΔRn의 통계적으로 유의 한 증가가 처음 감지하는주기입니다.

2.3. 데이터 분석

1. Generat개 표준 곡선은 C _{T 수치를} 사용하여 텔로 머라 제 활성을 비교합니다.

결과

텔로미어 길이 QRT-PCR 분석의 예는 그림 1에 표시됩니다. 왼쪽 패널에서 빨간색과 녹색으로 표시된 샘플 96 - 웰 플레이트에 시험 대상의 위치를​​ 나타냅니다. 오른쪽 상단 패널에서 증폭 곡선이 설명된다. 각 과목은 triplicates에서 이루어집니다 개의 분석 (Telomere는 및 단일 복사본 유전자)에 의해 테스트됩니다. 선택한 개인의 두 분석에서 생산 된 서로 다른 DNA 카피 수에 의한, 형광 ...

토론

텔로미어 길이는 스트레스와 노화 세포를 연구하는 독특한 세포 마커를 제공하고 노화의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 노화의 역할이 처음 제안했던 이후로, 연구의 다수가 나이 텔로미어 길이를 관련 완료되었습니다 근속 기간, 연령과 관련된 질환, 암, 스트레스. 수십 년 동안, 텔로미어 길이 측정의 황금 표준 남부 하이브리드를 사용하여 터미널 제한 조각 분석했다. 그러나 최근 Cawt...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516