Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

Resumo

Um método preciso, curto, sofisticado e barato é descrito que avalia o comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos e espécies usando qRT-PCR. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Resumo

Os telómeros são sequências de ADN de repetição na ponta extremidades dos cromossomas, que são diferentes em comprimento e em seres humanos pode atingir um comprimento de 15000 pares de bases. Os telómeros serve como um mecanismo de atrito bioprotector cromossoma em cada divisão celular. A um certo comprimento, os telómeros tornar demasiado curto para permitir a replicação, um processo que pode conduzir à instabilidade do cromossoma ou morte celular. O comprimento do telômero é regulada por dois mecanismos opostos: atrito e alongamento. Atrito ocorre à medida que cada célula se divide. Em contraste, o alongamento é modulado em parte pela enzima telomerase, que adiciona as sequências de repetição para as extremidades dos cromossomas. Desta forma, a telomerase pudesse inverter um mecanismo de envelhecimento e rejuvenesce viabilidade celular. Estes são elementos cruciais na manutenção da vida celular e são utilizadas para avaliar o envelhecimento celular. Neste artigo vamos descrever um método pouco preciso, sofisticado e barato para avaliar o comprimento dos telômeros em tecido múltiplas e espécies. Este método tira vantagem de dois elementos chave, a repetição em tandem da sequência do telómero e da sensibilidade do qRT-PCR para detectar números de cópias diferenciais de amostras testadas. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Introdução

Os telômeros são repetitivas de DNA hexâmeros (TTAGGG) seqüências encontradas nas extremidades dos cromossomos. Em cada replicação celular, essas extremidades dos cromossomas são encurtados. Se eles se tornam muito curtos, os cromossomos podem sofrer fusão telômero finais, recombinação aberrante e degradação. Assim manutenção comprimento dos telômeros suficiente desempenha um papel importante na estabilidade dos cromossomas e proteção da célula ^38. Manutenção comprimento do telômero também é crucial para genes encontrados perto das extremidades dos cromossomos, uma vez que a replicação do DNA não pode continuar até o fim de cromossomos ^1-2. Consequentemente, a prevenção do encurtamento dos telômeros pode melhorar a estabilidade da pilha.

Numerosos estudos têm avaliado que o comprimento dos telómeros está correlacionada com a longevidade de um organismo e estado de doença, tais como cancro, em ^{3-4, 5} a diabetes, doença cardiovascular e ^6,7. Além disso, os telómeros encurtados têm sido associados com o stress excessivo ouestilo de vida saudável ^8, talvez, promovendo o envelhecimento prematuro e morte celular ^9. Por outro lado, alguns estudos demonstraram que não há diferença significativa entre o comprimento dos telômeros e longevidade e doenças relacionadas com idade ^{39, 40, 41.}

Um dos mecanismos inatos da célula de proteção de encurtamento dos telômeros está ativando sua própria enzima telomerase transcriptase reversa (TERC). Esta enzima e sua subunidade, o RNA da telomerase (TERC), um RNA não-codificante, utilizar o telómero como um molde para adicionar repete telomere para as extremidades do cromossoma ^10. Embora a atividade telomerase está ausente de vários tipos de células e outros mecanismos estão envolvidos na manutenção do comprimento dos telômeros, o aumento da atividade da telomerase está correlacionada com o aumento do comprimento dos telômeros. Activação de telomerase foi estabelecido como um dos mecanismos pelos quais as células respondem a danos e stress e senescência prematura e evitar a morte. Por exemplo, mais de telomeres foram demonstrados em uma população de judeus Ashkenazi com uma excepcional duração ^11, as mutações em TERC ou terc foram mostrados para contribuir para a doença fatal, ^12, e regulação epigenética da telomerase foi demonstrado ter um efeito sobre a doença relacionada com a idade ^13. Desde a sua descoberta, o comprimento dos telómeros foi proposto como um biomarcador para o estado de saúde em diversos modelos animais, bem como em seres humanos, mas estes primeiros estudos foram difíceis de replicar amplamente porque o método utilizado foi tedioso, longo e dispendioso. Em 2002 e mais sintonizado em 2009, Cawthon propôs e demonstrou um novo protocolo preciso, rápido e simples PCR baseado para avaliar o comprimento dos telômeros e investigar o seu papel em vários aspectos da biologia celular, envelhecimento e doença ^19.

Escolher o método de medição dos telômeros correto para um estudo é essencial. Atualmente, existem vários métodos usados ​​para medir o comprimento dos telômeros, cada um com o seu própriovantagens e desvantagens. Tradicionalmente, o comprimento dos telómeros é medido utilizando a análise de Southern Blot de fragmentos de restrição terminal (TRF), que envolve: a. digerir o ADN com enzimas de restrição que não cortam no repete telomere, a fim de obter TRFs, b. Southern Blot destas TRFs é feito através da determinação do comprimento TRF significativo utilizando uma sonda telomérica ^{14, 37.} Embora este método seja altamente preciso, com um pequeno coeficiente de variação é uma medida directa, e pode ser vantajoso para a medição da distribuição do comprimento, a análise TRF é caro, trabalhoso e requer, pelo menos, 3 ug de DNA. Este método também é insensível à telómeros curtos e determinação comprimento pode ser confundida pelo DNA subtelomérica, que pode ser detectado pela sonda devido a (TTAGGG) n como sequências que contêm ^{15, 42.}

Outro método de alta precisão para medir o comprimento dos telômeros é Única dos telômeros Alongamento Análise Comprimento (STELA), um singlmolécula e método baseado em PCR que requer apenas uma pequena quantidade de DNA. Neste método, os iniciadores são feitas para reconhecer o G-rico saliência na extremidade dos cromossomas e para se ligar a uma sequência de subtelomérica única sobre um cromossoma, o qual amplifica o telómero de um cromossoma específico. A amplificação resultante é, então, visualizado por Southern Blot. Este método tem a vantagem de ser altamente precisa e é capaz de detectar os telómeros outlier curtas ^16. Infelizmente, uma vez que nem todos os cromossomos têm extremidades G-ricos e uma seqüência subtelomérica utilizável, o comprimento dos telômeros só pode ser medido em cromossomos específicos e essas medidas podem não representar o comprimento de todos os telômeros nas células ^15.

Outro método que tem sido praticado é o uso do ácido nucleico de péptido (ANP) sondas para detectar comprimento dos telómeros. Florescimento quantitativa em hibridização in situ (Q-FISH) nos permite visualizar os telômeros durante a metáfase, onde a ruaaining dos telómeros com uma sonda de PNA, em proporção ao seu tamanho permite a comparação dos telómeros entre cromossomas específicos. Embora este método também pode ser usado para células na interfase, aqui o comprimento dos telómeros para cromossomas diferentes não pode ser detectado, o que introduz uma limitação quando medição do comprimento dos telómeros nas células senescentes, ou raramente divisória ^17. FISH fluxo em vez disso usa citometria de fluxo e é atualmente o método mais sensível para medir o comprimento dos telômeros das células do sangue na clínica, mas exige técnicos altamente qualificados ^18.

Actualmente, o método padrão para a medição do comprimento dos telómeros, em média, o nosso laboratório tem a vantagem de precisão, sensibilidade e facilidade de PCR quantitativa em tempo real. Este método só foi possível por medição do comprimento dos telómeros pelo desenvolvimento de novos iniciadores que evitam a síntese de dímeros de iniciadores produtos derivados, que teriam sido produzidas comoensaio tandard devido à natureza repetitiva de telômeros. Para este ensaio, a medição do comprimento de telómeros é representado pela razão T / S, o número de cópias de repetição telomérica para o número de genes de cópia única. Uma vez que existe uma relação proporcional directa entre o comprimento dos telómeros e o número de iniciadores marcados telomere ligação ao ADN durante os estágios iniciais de PCR, a razão T / S é directamente proporcional ao comprimento dos telómeros. A razão T / S é medida pela comparação da diferença de Ct, o número do ciclo fraccionada em que a amostra é de fluorescência acumulada cruza um limite que é de vários desvios padrão acima da linha de base de fluorescência, entre as amostras, com os primários telomere iniciadores e SCG ^19. Este método tem sido criticado por sua medida indireta do comprimento dos telômeros, o que pode levar a medições imprecisas, por exemplo, no caso da duplicação de cromossomos ou cópia variações número ^15. Além disso, a comparação entre os estudos é muitas vezes difficult, mas padrão oligômeros foram desenvolvidos para medir o comprimento dos telômeros absoluta ^20. Este método foi melhorado por promoveu Cawthon, utilizando um ensaio multiplex qPCR monocromática. Neste ensaio, o PCR foi executado a temperaturas mais baixas para os primeiros ciclos para evitar a ligação de dímeros de iniciadores e o gene telómeros e de controlo foram analisados ​​no mesmo tubo de PCR, para evitar uma maior erro. As medidas de comprimento dos telômeros resultantes fortemente correlacionada com o comprimento dos telômeros medidos por análise de Southern blot dos TRFs e teve maior precisão ^{15, 19, 36.} No momento, qRT-PCR é o único método prático disponível para testar amostras de grande tamanho e requer apenas uma pequena quantidade de ADN para levar a cabo. Uma parte crucial do método tem medidas de controle de qualidade, de modo que quando ele é feito corretamente, este método pode fornecer informações comparativas valiosas sobre o comprimento dos telômeros. Adicionalmente, este método foi adaptado para utilização além de leucócitos para medircomprimento dos telómeros numa variedade de diferentes tecidos ^42.

Além disso, a fim de melhor entender a biologia por trás manutenção comprimento dos telómeros e as interacções entre os dois efeitos opostos (isto é, telómeros de encurtamento durante a replicação e alongamento pela enzima telomerase), que acompanha o comprimento dos telómeros método com um ensaio adicional, que mede a actividade da telomerase.

Para este efeito, foi utilizado um protocolo de amplificação repetição telomérica, um ensaio in vitro. Resumidamente, foram lisadas preservada, células enzimaticamente activas repetições teloméricas sintetizados sobre um substrato de oligonucleótido usando a telomerase, e os produtos foram amplificadas usando PCR, na presença de SYBR Green. Os resultados foram então analisadas por comparação da amostra de controlo e os valores de limiar Ct. Desde telomerase é uma enzima sensível ao calor, um calor adicional controle tratado é executado ao lado de cada amostra ^21.

Ao medir o comprimento dos telômeros pode fornecer informações valiosas sobre o possível papel do comprimento dos telômeros na fisiopatologia do envelhecimento e da doença, o comprimento dos telômeros não é uma propriedade estática e é necessária mais informação para entender a função dos telômeros. Estudos a atividade da telomerase pode adicionar informações sobre os mecanismos de regulação comprimento dos telômeros. Por exemplo, a activação controlada de telomerase pode manter o comprimento do telómero e da proliferação celular, mas a activação descontrolada da telomerase pode resultar em cancro. Estes dois métodos de baixo custo para a frente e em linha reta combinados forneceu-nos não só com a evidência mais forte no sentido de uma relação entre o comprimento dos telômeros e da estabilidade celular, mas também uma visão mais aprofundada os possíveis mecanismos de encurtamento dos telômeros e recuperação. Com estes métodos esperamos elucidar a resposta da célula ao envelhecimento e vários estados de proliferação celular com o objetivo final de uma melhor compreensão do mechanis Centralms de biologia celular.

Protocolo

1. Comprimento dos telômeros Protocolo n º ¹⁹

1. O isolamento do DNA

Pode ser utilizado A maioria dos métodos de isolamento do ADN. Nosso Lab prefere Qiagen DNeasy Kit (# 69506) para as fontes de sangue. Dependendo da fonte de ADN, tais como fontes de bucais ou outro, um método de isolamento diferentes podem ser utilizados.

2. Iniciadores:

Todos os iniciadores são diluídas até uma concentração de caldo de 100pmoles/μl em água grau de PCR e armazenadas a -20 ° C até ser necessário. Stocks de trabalho dos iniciadores são feitas novas e são armazenadas a 20 ° C durante um curto período de tempo (de alguns meses.) Iniciadores dos padrões foram usados ​​para os telómeros e β-globina, a SCG, tal como descrito no O'Callaghan et ai ^20. .

Seqüências de primers:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3?

Nota: Os iniciadores são diluídas até uma concentração de trabalho de 10pmoles/μl, antes de se adicionar à mistura de reacção.

3. Diluição seriada do DNA genômico:

Diluições em série de ADN genómico e para Telo único gene de cópia (SCG) são criados para gerar uma curva padrão para o valor Ct do ensaio. O ADN genómico foi utilizado extraída a partir de linfócitos a partir de amostras de sangue. Estas diluições são criados através da diluição de ADN por PCR grau _de H ₂ 0 a cada concentração por um factor de 1,68 para se obter os dois conjuntos de diluições em série usando o mesmo DNA genómico. As concentrações iniciais foram optimizadas com base em experimentação e erro e pode precisar de ser ajustada quando se utiliza reagentes diferentes, instrumentos de ADN a partir de outras espécies, tipos de células, e SCG utilizados.

Nota: Diluição em série utilizando ADN genómico são feitos misturando suavemente e esperando pelo menos 15 minutos a uma hora before tendo o ADN para o próximo diluição. Cada diluição requer tempo para o DNA genómico de dissociar. Para o armazenamento, alíquotas de diluições em série de longo prazo em tiras de PCR para o armazenamento a -80 ° C. Cada tira de PCR é descongelado e usado uma vez para evitar ciclos de descongelamento congelamento, que podem danificar o DNA.

4. Reacção custos para RT-PCR

Instrumento utilizado: Roche480 Luz Cycler

Reagente: Roche Luz termociclador SYBR-green

Diluir as amostras de ADN de teste a uma concentração final de 10 ng / ul. Testamos concentração usando Nanodrop ou Qubit. Nós diluir o ADN para 10ng/μl 5ng/μl final. Nós não testar a concentração novamente.

Componentes da reação:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0	6 mL		H20	6 mL
Telo 1	0,2 mL		SCG 1	0,6 mL
Telo 2	1,8 mL		SCG 2	1,4 mL
Rxn mix	10 ul		Rxn mix	10 ul
DNA ou diluição em série	2 ul		DNA ou diluição em série	2 ul

Nota: Master Mix é feita sem o ADN e com um excesso de 5% a 10%.

Ambos Telo e SCG são executados juntos na mesma placa com o seguinte programa. Para testar a precisão, no mínimo, três repetições de cada amostra e controle deve ser executado. As variações nos iniciadores utilizados podem afectar os resultados. Nosso protocolo foi otimizado para funcionar da seguinte forma no Roche480 Luz Cycler e nossos primers.

Emdesnaturam mador inicial
10 min 95 ° C desnatura
Ciclismo
95 ° C 10 seg preensão
60 ° C, 5 segundos preensão
72 ° C 11 seg espera e única aquisição
Repita 45 a 55 vezes, conforme necessário

2. Quantitativa telomerase Detection (QTD) Protocol (Baseado no Kit QTD por Allied Biotech, Inc. gato. Não. MT3012)

Extrato de Preparação

1. Pellet células ou tecidos.
2. Lavar uma vez com PBS 1x.
3. Repellet e remove 1x PBS. *
4. Ressuspender o sedimento celular em 200 uL de 1 x tampão de lise por cada 10 ⁵ -10 ⁶ células ou 40-100 mg de tecido.
5. Incubar no gelo por 30 min.
6. Girar a amostra a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
7. Transferir 160 jil de sobrenadante para um tubo fresco e determinar a concentração de proteína.
8. Alíquota e rápido congelar o extrato restante em gelo seco / etanol, armazenar a -80 ° C.

* Em ta sua condição, a telomerase em células ou tecidos congelados é estável durante pelo menos um ano. Quando descongelado para uso, ressuspender as células imediatamente em 1 x Tampão de Lise.

2.1. Controles de ensaio

Controle de inactivação pelo calor: Para cada amostra, o tratamento térmico de um extracto de controlo adicional por incubação a 85 ° C durante 10 minutos antes do ensaio de actividade da telomerase.

Curva padrão para o modelo de controlo TSR: Executar PCR quantitativo em tempo real usando diluições de ATR, um oligonucleótido com uma sequência semelhante à iniciadores telomere incluídas no kit para gerar uma curva padrão.

1. Prepare 01:05 diluições da concentração TSR estoque (0,5 Amoles / l) com tampão de lise
2. Realizar o ensaio padrão de detecção da telomerase usando 1 fil de cada diluição TSR, incluindo a concentração de estoque. Essas diluições podem ser armazenados a 4 ° C durante pelo menos 2 semanas.

2.2. Ensaio da Actividade da Telomeraseusando QTD Real-Time PCR

1. Para cada amostra, adicione o seguinte a um tubo de PCR ou de parede fina placa de PCR (volume total de 25,0 mL):
   • 12,5 ul de 2 x Premix QTD
   • 1,0 ml de celular ou Extrato Tissue
   • 11,5 ul de água PCR Qualificado
2. Misturar bem
3. Programa de PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção de acordo com o programa abaixo:
   - 25 ° C durante 20 minutos (reacção da telomerase)
   - 95 ° C durante 10 min (passo de activação inicial de PCR)
   35-40 ciclos de:
   - 95 ° C durante 30 seg (desnaturação)
   - 60 ° C durante 30 segundos (emparelhamento)
   - 72 ° C durante 30 seg (extensão)
4. Coloque tubos PCR no termociclador e iniciar o programa de ciclismo.
5. Recolher o ciclo limiar ou C valor _T após ciclos de acabamento. O ciclo de limiar é o ciclo no qual é detectada pela primeira vez um aumento estatisticamente significativo de ΔRn.

2.3. Análise de Dados

1. Generatcurva padrão ea utilizar as leituras C _T e comparar a atividade telomerase.

Resultados

Um exemplo de um comprimento de ensaio de qRT-PCR dos telómeros é mostrado na Figura 1. No painel superior esquerdo, amostras marcadas em vermelho e verde representam a localização dos sujeitos testados na placa de 96 poços. No painel superior direito, a curva de amplificação é demonstrada. Cada indivíduo é testado por dois ensaios (telômero e único gene Copy), que é feito em triplicata. Devido a diferentes números de cópias de ADN produzidos nos dois ensaios de indivíduos seleccionados,...

Discussão

Comprimento Telômero proporciona um marcador celular única para o estudo da célula esforçado e envelhecimento e oferece perspectivas sobre os mecanismos de envelhecimento. Desde o seu papel no envelhecimento primeira tinha sido sugerido, uma infinidade de estudos têm sido feitos relativos comprimento dos telômeros de idade, longevidade, doenças relacionadas com a idade, câncer e estresse. Durante décadas, o padrão ouro de medidas de comprimento dos telômeros foi a análise de fragmentos de restrição do term...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516