אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Summary

שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה מתוארת מעריך כי אורך הטלומרים ברקמות ומינים באמצעות qRT-PCR מרובים. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

Abstract

הטלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים בקצה קצוות של הכרומוזומים שהם מגוונים באורך ובבני האדם יכול להגיע לאורך של 15,000 זוגות בסיסים. הטלומרים משמש כמנגנון bioprotective התשה כרומוזום בכל חלוקת תא. באורך מסוים, הטלומרים להיות קצרים מדי כדי לאפשר לשכפול, תהליך שעלול להוביל לחוסר יציבות כרומוזום או מוות של תאים. אורך הטלומרים מוסדר על ידי שני מנגנונים מנוגדים: התשה והתארכות. ההתשה מתרחשת כמו כל תא מתחלק. בניגוד לכך, התארכות היא באופן חלקי מווסתת על ידי אנזים טלומראז, שמוסיף רצפים חוזרים בקצוות של הכרומוזומים. בדרך זו, יכול אולי להפוך את הטלומראז מנגנון הזדקנות וממריץ כדאיות תא. אלה הם אלמנטים קריטיים בשמירה על חיי תא ומשמשים כדי להעריך את הזדקנות תאים. בכתב היד הזה נתאר שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה להערכת אורך הטלומרים ברקמות מרובותים ומינים. השיטה זו מנצלת את שני מרכיבים עיקריים, בד בבד החוזרת של רצף הטלומרים והרגישות של qRT-PCR כדי לזהות להעתיק מספרי הפרשים של דגימות שנבדקו. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

Introduction

הטלומרים הם חוזרים DNA hexamer (TTAGGG) רצפים שנמצאו בקצוות של הכרומוזומים. בכל שכפול של תא, קצוות הכרומוזומים אלה מקוצרים. אם הם הופכים לקצרים מדי, כרומוזומים יכולים לעבור התכת הטלומרים קצה, רקומבינציה החריגה, והשפלות. לכן תחזוקת אורך הטלומרים מספיק ממלאת תפקיד מרכזי ביציבות כרומוזום ותא הגנה ^38. תחזוקת אורך הטלומרים היא קריטית גם לגנים שנמצאו בסמוך לקצוות הכרומוזומים, מאז שכפול הדנ"א אינו יכול להמשיך עד הסוף של כרומוזומים ^1-2. כתוצאה מכך, מניעת ההתקצרות הטלומרים עשויה לשפר את יציבות תא.

מחקרים רבים דיווחו כי אורך הטלומרים הוא מתואם עם תוחלת חיים של האורגניזם ומצב חולה, כגון בסרטן ^3-4, סוכרת ^5, ומחלות לב וכלי דם ^6,7. בנוסף, הטלומרים התקצרו כבר קשורים ללחץ מופרז אואורח חיים לא בריא ^8, אולי על ידי קידום ההזדקנות המוקדם של תאים ומות ^9. מצד השני, כמה מחקרים מצאו כי אין הבדל משמעותי בין אורך הטלומרים ואריכות ימים וגיל ³⁹ קשור ^{מחלה, 40, 41.}

אחד מהמנגנונים המולדים של התא של הגנה מפני התקצרות הטלומרים הוא על ידי הפעלה משלה אנזים טלומראז ההפוך טרנסקריפטאז (טרט). אנזים זה והמקטע שלה, טלומראז RNA (TERC), RNA ללא קידוד, השתמשו הטלומרים כתבנית להוסיף הטלומרים חוזר לכרומוזום ¹⁰ מסתיים. למרות פעילות telomerase נעדר ממספר סוגים של תאים ומנגנונים אחרים מעורבים בתחזוקת אורך הטלומרים, פעילות telomerase גדלה מתואמת עם אורך הטלומרים מוגבר. הפעלת Telomerase כבר נקבע כאחד מהמנגנונים שבאמצעותם תאים מגיבים לנזק ולהדגיש ולמנוע הזדקנות ומוות בטרם עת. לדוגמה, כבר telomeres הודגם באוכלוסייה של יהודים אשכנזים יוצאי דופן עם ¹¹ תוחלת חיים, מוטציות בTERC או טרט הוכחו לתרום למחלה קטלנית ^12, ורגולציה epigenetic של הטלומראז הוכח יש השפעה על מחלות הקשורות לגיל ^13. מאז גילויו, אורך הטלומרים הוצע כסמן ביולוגי למצב בריאות במודלים של בעלי חיים שונים, כמו גם בבני אדם, אך המחקרים המוקדמים הללו היו קשים לשכפל באופן נרחב, כי השיטה הייתה מייגע, ארוכה ויקרה. בשנת 2002, ועוד יותר מכוון בשינה 2009, הציע Cawthon והפגין פרוטוקול חדש, מדויק, מהיר ופשוט המבוסס על PCR להעריך אורך הטלומרים ועוד יותר לחקור את תפקידה בהיבטים שונים של ביולוגיה של תא, הזדקנות ומחלה ^19.

בחירת שיטת מדידת הטלומרים הנכונה עבור מחקר היא חיונית. כיום, ישנן שיטות שונות המשמשות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם עצמויתרונות וחסרונות. באופן מסורתי, אורך הטלומרים נמדד באמצעות ניתוח דרום כתם של שברי הגבלת מסוף (TRFs), הכולל: א. לעכל את ה-DNA עם אנזימי הגבלה שלא לקצץ בחזרות הטלומרים על מנת לקבל TRFs, ב. כתם דרומי של TRFs אלה נעשה על ידי קביעת אורך TRF הממוצע באמצעות בדיקה telomeric ^{14, 37.} למרות ששיטה זו היא מאוד מדויקת עם מקדם קטן של וריאציה, הוא מדד ישיר, ויכול להיות יתרון למדידת אורך הפצה, ניתוח TRF הוא יקר, עבודה אינטנסיבית ודורש לפחות 3 מיקרוגרם של ה-DNA. שיטה זו היא גם רגישה לטלומרים קצרים וקביעת אורך יכול להיות מבולבלת על ידי דנ"א subtelomeric, אשר יכול להיות מזוהה על ידי הבדיקה נאותה (TTAGGG) n כמו רצפים שהם מכילים ^{15, 42.}

שיטה נוספת מאוד מדויקת במדידת אורך הטלומרים היא ניתוח יחיד הטלומרים התארכות אורך (סטלה), Singlשיטת ה-PCR מולקולה מבוססת שדורשת כמות קטנה של DNA בלבד. בשיטה זו, פריימרים עשויים להכיר בסככה G-העשירה בסופו של הכרומוזומים ולהיקשר לרצף subtelomeric ייחודי על כרומוזום אחד, אשר מגביר את הטלומרים של כרומוזום מסוים. ההגברה המתקבלת היא אז דמיינו ידי כתם דרום. לשיטה זו יתרון של להיות מדויק מאוד והוא מסוגל לזהות טלומרים קצרים outlier ^16. לרוע המזל, מכיוון שלא כל הכרומוזומים קצוות G-עשירים ורצף subtelomeric שמיש, אורך הטלומרים יכול להימדד רק על כרומוזומים ספציפיים ומדידות אלה עשויות שלא לייצג את אורכו של כל הטלומרים בתא ^15.

שיטה נוספת שכבר מתורגלת היא השימוש בחומצות גרעין פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות לגילוי אורך הטלומרים. תפרחת כמותית הכלאה באתרו (Q-דגים) מאפשרת לנו לדמיין את הטלומרים במהלך metaphase, שם הרחובaining של הטלומרים עם בדיקה הרשות הפלסטינית באופן יחסי לגודל שלהם מאפשר השוואה של הטלומרים בין כרומוזומים ספציפיים. למרות ששיטה זו יכולה לשמש גם לתאים בשלבי ביניים, כאן לא יכול להיות מזוהה על אורך הטלומרים לכרומוזומים שונים, אשר מציג מגבלה בעת מדידת אורך הטלומרים בתאים מזדקנים או לעתים רחוקות חלוקת ^17. דגים במקום זרימה משתמש cytometry זרימה, וכיום הוא השיטה רגישה ביותר למדידת אורך הטלומרים של תאי דם בסביבה הקלינית, אבל דורש טכנאים מיומנים מאוד ^18.

נכון לעכשיו, השיטה הסטנדרטית למדידת אורך הטלומרים ממוצע במעבדה שלנו מנצלת את הדיוק, הרגישות, וקלות כמותי בזמן אמת PCR. שיטה זו התאפשרה למדידת אורך הטלומרים על ידי הפיתוח של פריימרים רומן למנוע את הסינתזה של מוצרי שמקורם בדימר פריימר, אשר במקרה אחר היה מיוצרת כבassay tandard בשל האופי החוזר של הטלומרים. עבור assay זה, מדידת אורך הטלומרים מיוצגת על ידי T / S היחס, מספר העותק חוזר הטלומרים למספר גני עותק יחיד. מאז יש קשר ישיר בין יחסי אורך הטלומרים ומספר פריימרים הטלומרים שכותרתו מחייב את ה-DNA בשלבי ההתחלה של ה-PCR, יחס T / S הוא ביחס ישר לאורך הטלומרים. יחס T / S נמדד על ידי השוואה את ההבדל ב-CT, מספר מחזור השבר שבמדגם של הצטברו תפרחת חוצה סף שהוא כמה סטיות תקן מעל תפרחת תחילת המחקר, בין דגימות עם פריימרים הטלומרים וSCG פריימרים ^19. שיטה זו זכתה לביקורת על מדידתו העקיפה של אורך הטלומרים, אשר יכול להוביל למדידה לא מדויקת, למשל, במקרה של כפילויות כרומוזום או וריאציות של מספר עותקים ^15. כמו כן, השוואה בין מחקרים היא לעתים קרובות דיfficult, אבל סטנדרטי oligomers פותחו כדי למדוד את אורך הטלומרים ²⁰ מוחלט. שיטה זו קדמה משופרת על ידי Cawthon, באמצעות assay qPCR זמנית בצבע אחד. ב assay זה, ה-PCR הייתה לרוץ בטמפרטורות נמוכות יותר לכמה מחזורים הראשונים, כדי למנוע מחייב פריימר-dimer וגן הטלומרים ובקרה נותחו באותו הצינור PCR להימנע משגיאה נוספת. את מדידות אורך הטלומרים המתקבלות מתואמות חזקות עם אורך הטלומרים נמדד על ידי ניתוח כתם דרומי של TRFs ודיוק גבוה יותר היה ^{15, 19, 36.} באותו הרגע, qRT-PCR היא השיטה הנוחה זמינה רק לבדיקת מדגמים גדולים ורק דורשת כמות קטנה של DNA לביצוע. חלק חיוני של שיטה זו הוא אמצעי בקרת איכות מקיפה, כך שכאשר עושה את זה כמו שצריך, בשיטה זו יכולה לספק מידע השוואתי רב ערך על אורך הטלומרים. בנוסף, בשיטה זו הייתה מותאמת לשימוש מעבר למדידת לויקוציטים אורך הטלומרים במגוון רחב של רקמות שונות ^42.

בנוסף לכך, על מנת להבין את הביולוגיה מאחורי תחזוקת אורך הטלומרים ויחסי גומלין בין שתי תופעות המנוגדות (כלומר קיצור הטלומרים במהלך שכפול והתארכות על ידי אנזים טלומראז) נוסף, אנו מלווים את שיטת אורך הטלומרים עם assay נוסף שמודד את פעילות טלומראז.

לצורך כך, אנו משמשים פרוטוקול הגברה חזור Telomeric, assay במבחנה. בקצרה, lysed, נשמר, תאי enzymatically פעילים מסונתזים חוזר telomeric על גבי מצע oligonucleotide באמצעות הטלומראז, ואת המוצרים באמצעות PCR היו מוגבר בנוכחות SYBR הירוקה. התוצאות נותחו על ידי השוואת מדגם וערכי סף ה-CT בקרה. מאז הטלומראז הוא אנזים רגיש לחום, חום נוסף שטופל שליטה לרוץ לצד כל מדגם ^21.

יש צורך "jove_content"> בעת מדידת אורך הטלומרים יכולה לספק תובנה חשובה התפקיד האפשרי של אורך הטלומרים בפתופיזיולוגיה של הזדקנות ומחלות, אורך הטלומרים אינו מאפיין סטטי ומידע נוסף כדי להבין פונקצית הטלומרים. מחקרי פעילות telomerase יכולים להוסיף מידע על מנגנוני רגולצית אורך הטלומרים. לדוגמה, ההפעלה המבוקרת של הטלומראז יכולה לשמור על אורך הטלומרים והתפשטות תאים, אך הפעלה בלתי מבוקרת של הטלומראז יכולה לגרום לסרטן. שתי שיטות קדימה זולות וישרות אלה בשילוב סיפק לנו לא רק עם ראיות חזקות יותר לכיוון קשר בין אורך הטלומרים ויציבות תא, אלא גם תובנה נוספת לתוך המנגנונים האפשריים של התקצרות הטלומרים והתאוששות. בעזרת שיטות אלה אנו מקווים להבהיר את התגובה של התא להזדקנות ומצבים שונים של התפשטות תאים נוספים עם המטרה הסופית של הבנה טובה יותר של mechanis המרכזיMS של ביולוגיה של תא.

Protocol

1. פרוטוקול אורך הטלומרים ¹⁹

1. בידוד ה-DNA

רוב שיטות בידוד DNA יכולה להיות בשימוש. המעבדה שלנו מעדיפה Qiagen DNeasy קיט (# 69,506) למקורות דם. בהתאם למקור של ה-DNA, כגון buccal או מקורות אחרים, ניתן להשתמש בשיטת בידוד שונה.

2. פריימרים:

כל פריימרים הם מדוללים בריכוז של מניית 100pmoles/μl במי כיתה PCR ומאוחסנים ב -20 ° C עד הצורך. מניות עבודה של פריימרים נעשות טריות ומאוחסנות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה קצרה של זמן (כמה חודשים). פריימרים רגילים שמשו לטלומרים וβ-גלובין, SCG, כפי שתוארו בO'Callaghan et al. ²⁰ .

רצפי פריימר:
1 Telo: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 "

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 "
1 SCG: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 "
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

הערה: צבעי יסוד הם מדוללים לריכוז עבודה של 10pmoles/μl, לפני הוספה לתערובת תגובה.

3. דילול הסדרה של הדנ"א הגנומי:

דילולים סדרתי של הדנ"א הגנומי לTelo וג'ין עותק בודד (SCG) נוצרים כדי ליצור עקומת ערך Ct סטנדרטית עבור assay. הדנ"א הגנומי משמש היה שחולץ מן הלימפוציטים מדגימות דם. דילולים אלה נוצרים על ידי דילול PCR DNA עם כיתה H ₂ 0 לכל ריכוז בפקטור של 1.68 להניב שני הסטים של דילולים סדרתי שמשתמשים באותו הדנ"א הגנומי. הריכוזים המתחילים כבר מותאמים המבוססים על ניסוי וטעייה, וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בעת שימוש בחומרים כימיים שונים, כלי נגינה, DNA ממינים אחרים, סוגי תאים, ומשמש SCG.

הערה: דילול סידורי באמצעות הדנ"א הגנומי נעשים על ידי ערבוב בעדינות ומחכה לפחות 15 דקות לשעה אחת befoלקיחה מחדש של DNA לדילול הבא. דילול כל דורש זמן להדנ"א הגנומי לנתק. לאחסון, aliquot דילולים סדרו לטווח ארוך לרצועות PCR לאחסון ב -80 ° C. כל רצועת PCR הוא הפשיר והשתמשה פעם אחת, כדי למנוע מחזורי ההפשרה הקפאה שעלול לגרום נזק לדנ"א.

4. הגדרת תגובה לRT-PCR

מכשיר בשימוש: Cycler אור Roche480

מגיב: רוש האור Cycler SYBR הירוק

לדלל דגימות DNA בדיקה לריכוז סופי של 10 ng / μl. אנחנו בודקים באמצעות ריכוז Nanodrop או קיוביט. בנוסף, אנו לדלל את ה-DNA מ10ng/μl ל5ng/μl הסופי. אנחנו לא לבדוק את הריכוז שוב.

מרכיבי תגובה:

Telo	1x		SCG	1x
H 2 0	6 μl		H20	6 μl
1 Telo	0.2 μl		SCG 1	0.6 μl
Telo 2	1.8 μl		SCG 2	1.4 μl
Rxn תמהיל	10 μl		Rxn תמהיל	10 μl
DNA או דילול סדרתי	2 μl		DNA או דילול סדרתי	2 μl

הערה: מיקס מאסטר נעשה ללא DNA ועם עודף של 5% עד 10%.

שניהם Telo וSCG מנוהלים יחד על אותה צלחת שימוש בתכנית הבאה. לבדיקת דיוק, לפחות שלושה משכפל של כל דגימה ובקרה יש להפעיל. וריאציות בפריימרים המשמשים עשויות להשפיע על התוצאות. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם לעבודה באופן הבא את האור Cycler Roche480 ופריימרים שלנו.

בתוךלפגל itial
10 דקות לפגל 95 מעלות צלזיוס
רכיבה על אופניים
95 ° C 10 שניות אחיזה
60 ° C ההמתנה 5 שניות
72 מעלות צלזיוס ההמתנה 11 שניות ורכישה אחת
חזור על 45 עד 55 פעמים כנדרש

2. (QTD) איתור Telomerase כמותית פרוטוקול (בהתבסס על ערכת QTD על ידי בעלות הברית ביוטק, Inc חתול. מס MT3012)

לחלץ הכנה

1. גלולה תאים או רקמות.
2. שטפי פעם עם 1x PBS.
3. Repellet ולהסיר 1x PBS. *
4. Resuspend התא גלולה ב 200 μl של מאגר תמוגה x 1 לכל 10 -10 ^{5 6} תאים או 40-100 מ"ג של רקמה.
5. לדגור על קרח למשך 30 דקות.
6. ספין למטה מדגם XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C.
7. להעביר 160 μl של supernatant לתוך צינור טרי ולקבוע את ריכוז חלבון.
8. Aliquot ומהיר להקפיא את התמצית שנותרה על קרח / אתנול יבש, החנות ב -80 ° C.

* בtמצבו, הטלומראז בתאים או רקמות קפואים הוא יציב במשך לפחות שנה. כשהפשרת לשימוש, resuspend התאים באופן מיידי במאגר 1 X תמוגה.

2.1. בקרת assay

שליטת חום איון: לכל דגימה, לחמם טיפול תמצית שליטה נוספת על ידי דוגרים על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני assay פעילות טלומראז.

עקומת סטנדרט לתבנית שליטת TSR: בצע כמותי Real-Time PCR באמצעות דילולים של TSR, oligonucleotide עם רצף דומה לפריימרים הטלומרים כלולים בערכה כדי ליצור עקומה סטנדרטית.

1. הכן דילולים סדרו 01:05 לריכוז TSR המניות (0.5 amoles / μl) עם מאגר תמוגה
2. לבצע את assay סטנדרטי איתור הטלומראז באמצעות μl 1 של דילול כל TSR, כולל ריכוז המניות. ניתן לאחסן דילולים אלה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות.

2.2. Assay פעילות Telomeraseבאמצעות QTD Real-Time PCR

1. עבור כל דגימה, להוסיף את הדברים הבאים לצינור PCR או קיר דק PCR צלחת (נפח כולל μl 25.0):
   • 12.5 μl של Premix QTD 2 x
   • 1.0 μl של תא או תמצית רקמות
   • 11.5 μl של מים מוסמכים PCR
2. מערבבים היטב
3. תכנית בזמן אמת מערכות איתור PCR על פי התכנית שלהלן:
   - 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (תגובת הטלומראז)
   - 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (שלב הפעלה ראשוני PCR)
   35-40 מחזורים של:
   - שנייה 95 מעלות צלזיוס למשך 30 (denaturation)
   - 60 שניות מעלות צלזיוס למשך 30 (חישול)
   - 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (ארכה)
4. הנח צינורות PCR בCycler התרמית ולהפעיל את תכנית רכיבה על אופניים.
5. לאסוף את מחזור הסף או C ערך _T לאחר סיום מחזורים. מחזור הסף הוא המחזור שבו עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של ΔRn הוא זוהה לראשונה.

2.3. ניתוח נתונים

1. Generatעקומת סטנדרט EA באמצעות קריאות _t C ולהשוות פעילות טלומראז.

תוצאות

דוגמה של assay qRT-PCR אורך הטלומרים מוצגת באיור 1. בפנל השמאלי העליון, שכותרתו דגימות באדום וירוק מייצגות את מיקומם של נושאים שנבדקו על 96 גם הצלחת. בלוח הימני העליון, עקומת ההגברה הפגינה. כל נושא נבדק על ידי שני מבחני (ג'ין העתקת הטלומרים ויחיד), אשר נעשה בtriplicates. ב...

Discussion

אורך הטלומרים מספק סמן סלולרי ייחודי ללמוד תא לחוץ והזדקנות ומציע תובנות לתוך המנגנונים של הזדקנות. מאז תפקידה בהזדקנות היה ראשון הוצע, מספר רב של המחקרים נעשה נוגע אורך הטלומרים לגיל, תוחלת חיים, מחלות הקשורות לגיל, סרטן, ולחץ. במשך עשרות שנים, ברמה של מדידות אורך הטל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516