Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

Zusammenfassung

Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Zusammenfassung

Telomere sind wiederholenden DNA-Sequenzen an den vorderen Enden der Chromosomen, die unterschiedlich sind in der Länge und im Menschen eine Länge von 15.000 Basenpaaren zu erreichen. Die Telomere dient als bio-Mechanismus des Chromosoms Abrieb bei jeder Zellteilung. Bei einer bestimmten Länge, werden die Telomere zu kurz, um die Replikation, ein Prozess, der auf Chromosom Instabilität oder Zelltod führen können zulassen. Abrieb und Dehnung: Telomere Länge wird durch zwei gegenläufige Mechanismen reguliert. Attrition tritt als jeder Zelle teilt. Im Gegensatz dazu ist Dehnung teilweise moduliert durch die Telomerase, die sich wiederholenden Sequenzen fügt an den Enden der Chromosomen. Auf diese Weise könnte möglicherweise Telomerase Reverse Mechanismus eine alternde und verjüngt die Lebensfähigkeit der Zellen. Dies sind entscheidende Elemente bei der Aufrechterhaltung der Lebensdauer der Zelle und werden verwendet, um die Zellalterung zu beurteilen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode, um die Länge der Telomere in mehrere Gewebe beurteilens und Arten. Dieses Verfahren nutzt zwei zentrale Elemente, die Tandem-Repeat des Telomer-Sequenz und die Empfindlichkeit der qRT-PCR an Differential Kopienzahl der getesteten Proben zu erkennen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Einleitung

Telomere sind wiederholenden DNA Hexamer (TTAGGG) Sequenzen an den Enden der Chromosomen gefunden. In jeder Zelle Replikation werden diese Chromosomen-Enden verkürzt. Wenn sie zu kurz werden, können Chromosomen unterziehen Telomerende Fusionen, anomale Rekombination und Abbau. So reicht die Länge der Telomere Wartung spielt eine wichtige Rolle in Chromosom Stabilität und Zellschutz ^38. Telomere Länge Wartung ist auch entscheidend für die Gene in der Nähe der Enden der Chromosomen gefunden, da die DNA-Replikation kann nicht bis zum Ende der Chromosomen ^1-2 fortzusetzen. Folglich kann Prävention von Telomerverkürzung verbessern Zelle Stabilität.

Zahlreiche Studien haben berichtet, dass die Länge der Telomere mit einem Organismus die Langlebigkeit und krankem Zustand, wie bei Krebs ^3-4, Diabetes ^5, und Herz-Kreislauferkrankungen ^6,7 korreliert ist. Darüber hinaus haben verkürzte Telomere mit übermäßiger Stress oder in Verbindung gebrachtungesunde Lebensweise ^8, vielleicht durch die Förderung vorzeitige Zellalterung und Tod ^9. Auf der anderen Seite haben einige Studien festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen Telomere und Langlebigkeit und altersbedingte Krankheiten ^{39, 40, 41.}

Einer der Zelle angeborenen Mechanismen zum Schutz von Telomerverkürzung ist durch die Aktivierung seiner eigenen Enzym Telomerase Reverse Transkriptase (tert). Dieses Enzym und seine Untereinheit Telomerase RNA (TERC), eine nicht-kodierende RNA, verwenden Sie die Telomere als Vorlage für Telomerwiederholungen auf Chromosom ¹⁰ endet hinzufügen. Obwohl Telomerase-Aktivität fehlt aus verschiedenen Arten von Zellen und andere Mechanismen in Telomerelänge Instandhaltungsarbeiten, erhöht Telomeraseaktivität mit erhöhter Telomerelänge korreliert. Telomerase-Aktivierung wurde als einer der Mechanismen, mit denen Zellen auf Schäden reagieren und betonen und vermeiden vorzeitige Alterung und Tod festgestellt. Beispielsweise länger telomeres in einer Population von aschkenasischen Juden mit außergewöhnlicher Lebensdauer ¹¹ wurden nachgewiesen wurden Mutationen in TERC oder tert wurde gezeigt, dass zur tödlichen Krankheit ¹² und epigenetische Regulation der Telomerase beitragen hat sich gezeigt, um eine Wirkung auf altersbedingte Krankheiten ¹³ haben. Seit seiner Entdeckung hat die Länge der Telomere als Biomarker für den Gesundheitszustand in verschiedenen Tiermodellen sowie in Menschen vorgeschlagen worden, aber diese frühen Studien waren schwer zu weit replizieren, da die verwendete Methode war mühsam, langwierig und teuer. Im Jahr 2002 und im Jahr 2009 weiter abgestimmt, vorgeschlagen Cawthon und zeigte eine neue, präzise, ​​schnelle und einfache PCR-basiertes Protokoll, um die Länge der Telomere zu bewerten und weiter zu untersuchen, ihre Rolle in der verschiedene Aspekte der Zellbiologie, Altern und Krankheit ^19.

Die Wahl der richtigen Telomer Messverfahren für eine Studie ist unerlässlich. Derzeit gibt es verschiedene Verfahren verwendet werden, um die Länge der Telomere zu messen, jedes mit seinem eigenenVor-und Nachteile. Traditionell wird die Länge der Telomere gemessen unter Verwendung der Southern-Blot-Analyse von Terminal Restriktionsfragmente (TRFs), die beinhaltet: a. Verdauen der DNA mit Restriktionsenzymen, die in Telomerwiederholungen nicht geschnitten, um TRFs zu erhalten, b. Southern Blot dieser TRFs wird durch Bestimmung der mittleren TRF Länge mit einem Telomer-Sonden ^{14, 37} erfolgen. Dieses Verfahren ist zwar sehr genau mit kleinem Variationskoeffizient ist ein direktes Maß und kann vorteilhaft sein, zur Längenmessung Verteilung ist TRF Analyse teuer, arbeitsintensiv und erfordert mindestens 3 ug DNA. Auch dieses Verfahren ist unempfindlich gegenüber kurzen Telomeren und Längenbestimmung durch subtelomeren DNA, die von der Sonde durch das (TTAGGG) n-Sequenzen, wie sie in den ^{15, 42} detektiert werden kann verwechselt werden.

Eine weitere sehr genaue Methode zur Messung Telomerelänge ist Single Telomere Dehnung Länge Analysis (STELA), ein single Molekül PCR basierende Methode, die benötigt nur eine geringe DNA-Menge. Bei diesem Verfahren werden Primer hergestellt, um den G-reichen Überhang am Ende der Chromosomen zu erkennen und zu einer einzigartigen subtelomeren Sequenz auf einem Chromosom, die das Telomer eines Chromosoms spezifisch verstärkt binden. Die resultierende Verstärkung ist dann visualisiert Southern Blot. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie sehr genau und ist in der Lage zu erkennen, kurze Telomere ¹⁶ Ausreißer. Leider, denn nicht alle Chromosomen G-reichen Enden haben und eine brauchbare subtelomerischen Sequenz können die Länge der Telomere nur auf bestimmten Chromosomen gemessen werden und diese Messungen können nicht die Länge aller Telomere in der Zelle ^15.

Eine weitere Methode, die durchgeführt worden ist, ist die Verwendung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonden Telomerelänge erkennen. Quantitative Florescence in situ Hybridisierung (Q-FISH) ermöglicht es uns, Telomere während der Metaphase, wo die st visualisierenaining der Telomere mit einer PNA-Sonde im Verhältnis zu ihrer Größe ermöglicht den Vergleich von Telomeren zwischen spezifischen Chromosomen. Obwohl dieses Verfahren auch für die Zellen in der Interphase verwendet werden, dabei die Telomere für verschiedene Chromosomen können nicht erkannt werden, was stellt eine Beschränkung bei der Messung Telomere in seneszenten oder selten teilenden Zellen ^17. Flow-FISH verwendet stattdessen Durchflusszytometrie und ist derzeit die empfindlichste Methode zur Messung der Länge der Telomere von Blutzellen im klinischen Umfeld, aber erfordert hoch qualifizierte Techniker ^18.

Derzeit nimmt die Standard-Methode zur Messung durchschnittliche Länge der Telomere in unserem Labor Vorteil der Präzision, Empfindlichkeit und einfache quantitative real-time PCR. Dieses Verfahren ermöglicht wurde zur Messung Telomere durch die Entwicklung neuer Primer, die die Synthese von Primer-Dimer-abgeleiteten Produkten, die ansonsten wie es hergestellt worden sind, zu vermeiden,tandard Assay aufgrund der sich wiederholenden Natur der Telomere. Für diesen Test wird die Messung der Telomer-Länge durch die T / S-Verhältnis, die Telomer-repeat Kopienzahl zu single-copy-Gen Zahl dargestellt. Da eine direkte proportionale Beziehung zwischen der Länge der Telomere und die Anzahl der markierten Telomere Primer an die DNA während der Anfangsphase der PCR ist die T / S-Verhältnis direkt proportional zur Länge der Telomere. Die T / S-Verhältnis, indem die Differenz in Ct gemessen wird, kreuzt die fraktionierte Taktzahl bei der die Probe florescence angesammelt ist eine Schwelle, die mehrere Standardabweichungen über der Grundlinie Blüte ist, zwischen den Proben mit Telomer-Primer und Primer SCG ^19. Diese Methode hat für seine indirekte Messung der Länge der Telomere, die zu ungenauen Messungen führen können, zum Beispiel kritisiert worden, im Falle von Chromosom Vervielfältigungen oder Kopienzahl Variationen ^15. Auch ist der Vergleich zwischen den Studien oft difficult, aber Standard-Oligomere wurden entwickelt, um absolute Länge der Telomere ²⁰ messen. Diese Methode wurde gefördert durch auf Cawthon verbessert, mit einem Monochrom-Multiplex-qPCR-Assay. In diesem Test wurde die PCR bei niedrigeren Temperaturen in den ersten Zyklen ausführen, um Primer-Dimer-Bindung zu vermeiden und die Telomer-und Kontroll-Gen wurden in der gleichen PCR-Röhrchen analysiert werden, um weitere Fehler zu vermeiden. Die resultierenden Telomere Messungen stark mit Telomere durch Southern-Blot-Analyse gemessen TRFs korreliert und höhere Genauigkeit ^{15, 19, 36.} Im Moment ist qRT-PCR die einzige praktische Methode für die Prüfung großer Stichprobenumfang und benötigt nur eine geringe Menge an DNA durchzuführen. Ein wesentlicher Teil dieser Methode ist eine umfassende Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, so dass, wenn es richtig gemacht wird, kann diese Methode wertvolle vergleichende Informationen über die Länge der Telomere zu stellen. Darüber hinaus hatte diese Methode für den Einsatz jenseits Leukozyten zur Messung angepasstTelomere in einer Vielzahl von verschiedenen Geweben ^42.

Zusätzlich zur weiteren Verständnis der Biologie hinter Telomerelänge Wartung und Interaktionen zwischen den zwei gegenläufige Effekte (dh Telomerverkürzung während der Replikation und Dehnung der Telomerase), begleitet wir die Telomere Verfahren mit einem zusätzlichen Test, der Telomerase-Aktivität misst.

Zu diesem Zweck verwendeten wir eine Telomer-Repeat Amplification Protocol, ein in vitro-Assay. Kurz gesagt, lysiert erhalten, enzymatisch aktive Zellen Telomere auf ein Substrat unter Verwendung von Oligonukleotid-Telomerase synthetisiert, und die Produkte wurden unter Verwendung von PCR in Gegenwart von SYBR Green. Die Ergebnisse wurden dann durch den Vergleich der Proben, Kontrollen Ct Schwellenwerte analysiert. Da Telomerase ist ein wärmeempfindliches Enzym wird eine zusätzliche Wärme behandelten Kontrollgruppe nebeneinander Probe ²¹ ausgeführt.

Während der Messung die Länge der Telomere können wertvolle Einblicke in die mögliche Rolle der Telomer-Länge in der Pathophysiologie der Alterung und Krankheit zu schaffen, ist die Länge der Telomere nicht eine statische Eigenschaft und weitere Informationen benötigt wird, um Telomer-Funktion zu verstehen. Telomerase-Aktivität Studien hinzufügen können Informationen über die Länge der Telomere Regulationsmechanismen. Zum Beispiel kann die gesteuerte Aktivierung der Telomerase halten Telomere und Zellproliferation, aber die unkontrollierte Aktivierung von Telomerase in Krebs führen. Diese beiden kostengünstige und unkomplizierte Methoden kombiniert hat uns nicht nur mit stärkeren Beweise zu einer Beziehung zwischen Länge der Telomere und Zelle Stabilität, sondern auch einen tieferen Einblick in die möglichen Mechanismen der Verkürzung der Telomere und Erholung. Mit diesen Methoden, die wir hoffen, weiter aufzuklären die Antwort der Zelle auf Alterung und verschiedene Zustände der Zellproliferation mit dem Ziel eines besseren Verständnisses der zentralen mechanistischms der Zellbiologie.

Protokoll

1. Telomere Länge Protokoll ¹⁹

1. DNA-Isolierung

Die meisten DNA Isolierungsverfahren verwendet werden. Unsere Lab zieht Qiagen DNeasy Kit (# 69506) für Blut Quellen. Je nach Quelle der DNA, wie zB bukkal oder anderen Quellen kann eine andere Isolierungsverfahren verwendet werden.

2. Primer:

Alle Primer werden an einer Börse Konzentration 100pmoles/μl in PCR-Wasser verdünnt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Arbeiten Bestände Primer werden frisch zubereitet und sind bei 20 ° C gelagert für einen kurzen Zeitraum (ein paar Monate.) Standard-Primer für Telomere und β-Globin, die SCG verwendet wurden, wie in O'Callaghan et al. ²⁰ .

Primer-Sequenzen:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Hinweis: Primer werden auf eine Arbeitskonzentration von 10pmoles/μl verdünnt, vor der Zugabe zur Reaktionsmischung.

3. Verdünnungsreihe von genomischer DNA:

Serielle Verdünnungen von genomischer DNA für Telo und Single Copy Gen (SCG) werden erstellt, um eine Standard-CT-Kurve für den Test zu generieren. Die genomische DNA verwendet wurde aus Lymphozyten aus Blutproben extrahiert. Diese Verdünnungen werden durch Verdünnen DNA mit PCR Klasse H ₂ 0 zu jeder Konzentration um den Faktor 1,68, um die zwei Sätze von Verdünnungsreihen mit der gleichen genomischen DNA-Ausbeute hergestellt. Die Ausgangskonzentrationen wurden basierend auf Versuch und Irrtum optimiert und müssen angepasst werden, wenn mit verschiedenen Reagenzien, Instrumente, DNA von anderen Spezies, Zelltypen und SCG verwendet.

Hinweis: Die serielle Verdünnung unter Verwendung genomischer DNA werden durch vorsichtiges Mischen und einer Wartezeit von mindestens 15 Minuten bis zu einer Stunde befo gemachtre Entnahme von DNA für die nächste Verdünnung. Jede Verdünnung erfordert Zeit für die genomische DNA zu distanzieren. Für die langfristige Lagerung Aliquot serielle Verdünnungen in PCR-Streifen für die Lagerung bei -80 ° C. Jede PCR Streifen wird aufgetaut und einmal, um Frost-Tau-Zyklen, die DNA schädigen können, zu vermeiden verwendet.

4. Reaktionsansatz für RT-PCR

Instrument verwendet: Roche480 Light Cycler

Reagenz: Roche Light Cycler sybr-grün

Verdünnen Test-DNA-Proben auf eine Endkonzentration von 10 ng / ul. Wir testen mit Konzentration Nanodrop oder Qubit. Wir verdünnen die DNA aus 10ng/μl zur endgültigen 5ng/μl. Wir wissen nicht testen Konzentration wieder.

Reaction Komponenten:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0	6 ul		H20	6 ul
Telo 1	0,2 ul		SCG 1	0,6 ul
Telo 2	1,8 ul		SCG 2	1,4 ul
Rxn mix	10 ul		Rxn mix	10 ul
DNA oder serielle Verdünnung	2 ul		DNA oder serielle Verdünnung	2 ul

Hinweis: Master Mix ohne DNA und mit einem Überschuß von 5% bis 10% hergestellt.

Sowohl Telo und SCG sind zusammen auf der gleichen Platte mit dem folgenden Programm auszuführen. Um präzise zu testen, mindestens drei Wiederholungen für jede Probe und Kontrolle ausgeführt werden soll. Variationen in der verwendeten Primer kann die Ergebnisse beeinflussen. Unser Protokoll wurde optimiert, um wie folgt auf der Roche480 Light Cycler und unsere Primer arbeiten.

Initial denaturieren
10 min Denaturierung 95 ° C
Radfahren
95 ° C 10 sec halten
60 ° C 5 sec halten
72 ° C 11 sec halten und einzelne Akquisition
Wiederholen 45 bis 55 mal je nach Bedarf

2. Quantitative Telomerase Detection (QTD) Protokoll (Basierend auf QTD Kit von Allied Biotech, Inc. Cat. Nr. MT3012)

Auszug Vorbereitung

1. Pellet-Zellen oder Gewebe.
2. Waschen Sie einmal mit 1x PBS.
3. Repellet und entfernen 1x PBS. *
4. Zellpellet in 200 ul 1 x Lysis Buffer für alle 10 ⁵ -10 ⁶ Zellen oder 40-100 mg Gewebe.
5. Inkubieren auf Eis für 30 min.
6. Spin down die Probe bei 12.000 g für 30 min bei 4 ° C.
7. Übertragen Sie 160 ul der Überstand in ein frisches Röhrchen und Protein-Konzentration bestimmen.
8. Aliquotieren und schnell zu gefrieren die verbleibende Extrakt auf Trockeneis / Ethanol, bei -80 ° C.

* In tsein Zustand ist Telomerase in gefrorenen Zellen oder Gewebe für mindestens ein Jahr stabil. Wenn für die Verwendung aufgetaut werden die Zellen sofort in 1 x Lysis Buffer.

2.1. Testkontrollen

Hitzeinaktivierung Kontrolle: Für jede Probe Wärmebehandlung eine zusätzliche Kontrolle Extrakt durch Inkubation bei 85 ° C für 10 min vor der Telomerase-Aktivitätstest.

Standard-Kurve für TSR Kontrolle Vorlage: Führen Quantitative Real-Time PCR mit Verdünnungen von TSR, ein Oligonukleotid mit einer ähnlichen Sequenz Telomer-Primer mit dem Kit enthalten, um eine Standardkurve zu erzeugen.

1. Bereiten 01.05 serielle Verdünnungen der stock TSR Konzentration (0,5 Amoles / ul) mit Lysepuffer
2. Führen Sie die Telomerase Erkennung Standard-Assay unter Verwendung von 1 &mgr; l jeder Verdünnung TSR, einschließlich der Lager-Konzentration. Diese Verdünnungen können bei 4 ° C für mindestens 2 Wochen gelagert werden.

2.2. Telomerase-Aktivität AssayVerwendung QTD Real-Time PCR

1. Für jede Probe, fügen Sie Folgendes in einer PCR-Röhrchen oder dünnwandigen PCR-Platte (Gesamtvolumen 25,0 ul):
   • 12,5 ul 2 x QTD Premix
   • 1,0 ul Zelle oder eines Gewebes Extract
   • 11,5 ul PCR Qualified Wasser
2. Nach gründlichem Mischen
3. Programm Real-Time PCR Detection Systems entsprechend der unten Programm:
   - 25 ° C für 20 min (Telomerasereaktion)
   - 95 ° C für 10 min (PCR anfänglichen Aktivierungsschritt)
   35-40 Zyklen von:
   - 95 ° C für 30 Sekunden (Denaturierung)
   - 60 ° C für 30 sec (Annealing)
   - 72 ° C für 30 sec (Erweiterung)
4. Zeigen PCR-Röhrchen in den Thermocycler und starten Sie das Programm.
5. Sammeln Sie die Schwelle Zyklus oder C _T-Wert nach Zyklen Abgang. Der Schwellenwert-Zyklus ist der Zyklus, in dem eine statistisch signifikante Erhöhung der ΔRn zuerst erkannt wird.

2.3. Data Analysis

1. Generatea Standardkurve unter Verwendung der C _T-Werte und vergleichen Sie die Telomerase-Aktivität.

Ergebnisse

Ein Beispiel eines Telomerelänge qRT-PCR-Assay wird in Abbildung 1 gezeigt. Auf der oberen linken Seite, stellen Proben in rot und grün markiert den Standort der getesteten Probanden auf der 96-Well-Platte. Auf der oberen rechten Fensterbereich wird die Verstärkung Kurve demonstriert. Jedes Thema wird durch zwei Tests (Telomere und Single Copy Gen), die dreifach gemacht wird getestet. Aufgrund unterschiedlicher DNA-Kopien in den beiden Assays ausgewählter Individuen erzeugt, erreicht die Anzahl der ...

Diskussion

Telomere Länge bietet eine einzigartige zelluläre Marker, um die gestressten und alternden Zelle zu studieren und bietet Einblicke in die Mechanismen des Alterns. Seit seiner Rolle in alternden hatte zunächst vorgeschlagen worden, eine Vielzahl von Studien wurden durchgeführt, über die Länge der Telomere zu altern, Langlebigkeit, altersbedingte Krankheiten, Krebs und Stress. Jahrzehntelang war der Goldstandard der Länge der Telomere Messungen Terminal Restriktionsfragmentanalyse mit Southern-Hybridisierung. Doch ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516