Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare

Riepilogo

Un metodo preciso, corto, sofisticato ed economico è descritto che valuta la lunghezza dei telomeri nei diversi tessuti e specie utilizzando RT-PCR quantitativa. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l'attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.

Abstract

Telomeri ripetono sequenze di DNA alla estremità di punta dei cromosomi che sono diverse in lunghezza e nell'uomo può raggiungere una lunghezza di 15.000 coppie di basi. Il telomero serve come meccanismo bioprotettivi del cromosoma logoramento ad ogni divisione cellulare. A una certa lunghezza, i telomeri diventano troppo corti per consentire la replica, un processo che può portare ad instabilità cromosomica o morte cellulare. La lunghezza dei telomeri è regolato da due meccanismi opposti: logoramento e allungamento. Attrito si verifica come ogni cellula si divide. In contrasto, l'allungamento è parzialmente modulato dal enzima telomerasi, che aggiunge le sequenze ripetute alle estremità dei cromosomi. In questo modo, telomerasi potrebbe eventualmente invertire un meccanismo di invecchiamento e ringiovanisce vitalità cellulare. Questi sono elementi cruciali per il mantenimento della vita cellulare e sono utilizzati per valutare l'invecchiamento cellulare. In questo manoscritto si descrivono un accurato breve sofisticato ed economico metodo per valutare la lunghezza dei telomeri nel tessuto multiplas e specie. Questo metodo sfrutta due elementi fondamentali, il tandem ripetizione della sequenza telomero e la sensibilità del qRT-PCR per rilevare differenziali numeri di copie di campioni esaminati. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l'attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.

Introduzione

I telomeri stanno ripetendo DNA esamero (TTAGGG) sequenze trovati alle estremità dei cromosomi. In ogni replicazione cellulare, queste estremità cromosomiche sono accorciati. Se diventano troppo corti, i cromosomi possono subire fusioni telomeri finali, ricombinazione aberrante, e il degrado. Così sufficiente lunghezza dei telomeri manutenzione gioca un ruolo importante nella stabilità cromosomica e la protezione delle cellule ^38. Manutenzione lunghezza dei telomeri è fondamentale anche per i geni trovati vicino le estremità dei cromosomi, in quanto la replicazione del DNA non può continuare fino alla fine dei cromosomi ^1-2. Conseguentemente, la prevenzione dei telomeri può migliorare la stabilità delle cellule.

Numerosi studi hanno riportato che la lunghezza dei telomeri è correlata con la longevità di un organismo e stato di malattia, come ad esempio nel cancro ^{3-4, 5} diabete, malattie cardiovascolari e ^6,7. Ulteriormente, telomeri accorciati sono state associate a stress eccessivo o unstile di vita malsano ^8, magari favorendo l'invecchiamento precoce delle cellule e la morte ^9. D'altra parte, alcuni studi hanno trovato che non vi è alcuna differenza significativa tra la lunghezza dei telomeri e longevità e malattia legata all'età ^{39, 40, 41.}

Uno dei meccanismi innati della cella di protezione da telomeri è attivando un proprio enzima telomerasi trascrittasi inversa (TERT). Questo enzima e la sua subunità, telomerasi RNA (TERC), un RNA non codificante, usano il telomero come modello per aggiungere ripetizioni telomero finisce al cromosoma ^10. Anche se l'attività della telomerasi è assente da diversi tipi di cellule e altri meccanismi sono coinvolti nel mantenimento della lunghezza dei telomeri, una maggiore attività della telomerasi è correlata con una maggiore lunghezza dei telomeri. L'attivazione della telomerasi è stato stabilito come uno dei meccanismi con cui le cellule rispondono a danni e lo stress e di evitare la senescenza precoce e morte. Per esempio, più telomeres sono state dimostrate in una popolazione di ebrei Ashkenazi con eccezionale durata della vita ^11, mutazioni in TERC o TER hanno dimostrato di contribuire alla malattia fatale ^12, e la regolazione epigenetica della telomerasi ha dimostrato di avere un effetto sulla malattia legata all'età ^13. Dalla sua scoperta, la lunghezza dei telomeri è stata proposta come biomarker per lo stato di salute in vari modelli animali e negli esseri umani, ma questi primi studi erano difficili da replicare ampiamente quanto il metodo utilizzato era noioso, lungo e costoso. Nel 2002 e ulteriormente sintonizzati nel 2009, Cawthon proposto e dimostrato una nuova accurata PCR protocollo basato,, veloce e semplice per valutare la lunghezza dei telomeri e indagare ulteriormente il suo ruolo in vari aspetti della biologia cellulare, l'invecchiamento e la malattia ^19.

La scelta del metodo di misurazione dei telomeri corretto per uno studio è essenziale. Attualmente, ci sono vari metodi utilizzati per misurare la lunghezza dei telomeri, ognuno con la propriavantaggi e svantaggi. Tradizionalmente, la lunghezza dei telomeri è misurata usando l'analisi Southern Blot dei frammenti di restrizione terminali (TRFs), che prevede: a. digerendo il DNA con enzimi di restrizione che non tagliare in ripetizioni telomeriche per ottenere TRFs, b. Southern Blot di questi TRFs è fatto da determinare la lunghezza TRF media utilizzando una sonda telomerica ^{14, 37.} Anche se questo metodo è estremamente preciso con un piccolo coefficiente di variazione, è una misura diretta, e può essere vantaggioso per la misurazione distribuzione di lunghezza, analisi TRF è costoso, laborioso e richiede almeno 3 mg di DNA. Questo metodo è anche insensibile a telomeri corti e determinazione lunghezza può essere confuso da subtelomeric DNA, che può essere rilevato dalla sonda a causa della (TTAGGG) n come sequenze che contengono ^{15, 42.}

Un altro metodo molto preciso nella misurazione della lunghezza dei telomeri è unico telomeri Allungamento Lunghezza Analysis (STELA), un single molecola metodo basato sulla PCR che richiede solo una piccola quantità di DNA. In questo metodo, i primer sono fatti per riconoscere il G-ricchi sbalzo alla fine di cromosomi e di legarsi ad una sequenza subtelomeric unica su un cromosoma, che amplifica il telomero di un cromosoma specifico. L'amplificazione risultante è quindi visualizzato da Southern Blot. Questo metodo ha il vantaggio di essere estremamente preciso ed è in grado di rilevare valori anomali telomeri corti ^16. Purtroppo, dal momento che non tutti i cromosomi hanno le estremità G-ricchi e una sequenza subtelomeric utilizzabile, la lunghezza dei telomeri può essere misurata solo sui cromosomi specifici e queste misure non può rappresentare la lunghezza di tutti i telomeri nella cella ^15.

Un altro metodo che è stato praticato è l'uso di acido nucleico peptidico (PNA) sonde per rilevare la lunghezza dei telomeri. Florescence Quantitative ibridazione in situ (Q-FISH) ci permette di visualizzare i telomeri durante la metafase, dove la staining di telomeri con una sonda PNA in proporzione alla loro dimensione permette il confronto dei telomeri tra cromosomi specifici. Anche se questo metodo può essere utilizzato anche per le cellule in interfase, qui la lunghezza dei telomeri per i cromosomi distinti non può essere rilevato, che introduce una limitazione quando si misura la lunghezza dei telomeri in cellule senescenti o raramente divisione ^17. FISH flusso utilizza invece la citometria a flusso ed è attualmente il metodo più sensibile per misurare la lunghezza dei telomeri delle cellule del sangue in ambito clinico, ma necessita di tecnici altamente qualificati ^18.

Attualmente, il metodo standard per la misurazione della lunghezza media dei telomeri nel nostro laboratorio si avvale della precisione, sensibilità e facilità di quantitative real-time PCR. Questo metodo è stato reso possibile per la misurazione della lunghezza dei telomeri dallo sviluppo di nuovi primer che evitano la sintesi di prodotti di primer dimero-derivati, che sarebbe stato altrimenti prodotto in quantotandard saggio a causa della natura ripetizione dei telomeri. Per questo test, la misurazione della lunghezza del telomero è rappresentato dal rapporto T / S, il numero di ripetizione copia telomero a singola copia del gene numero. Poiché esiste una relazione proporzionale diretta tra la lunghezza dei telomeri e il numero di primer marcati telomeri legame al DNA durante le fasi iniziali di PCR, il rapporto T / S è direttamente proporzionale alla lunghezza dei telomeri. Il rapporto T / S è misurata confrontando la differenza di Ct, il numero di ciclo frazionario in cui il campione ha accumulato fluorescenza supera una soglia che è diverse deviazioni standard sopra la fluorescenza basale, tra campioni con primer telomeri e SCG primer ^19. Questo metodo è stato criticato per la misura indiretta della lunghezza del telomero, che può portare a misurazioni errate, per esempio, nel caso di duplicazioni cromosomiche o copiare variazioni del numero ^15. Inoltre, il confronto tra gli studi è spesso difficult, ma standard di oligomeri sono stati sviluppati per misurare la lunghezza dei telomeri assoluto ^20. Questo metodo è stato promosso migliorato dai Cawthon, utilizzando un monocromo saggio qPCR multiplex. In questo saggio, la PCR è stata eseguita a temperature più basse per i primi cicli di evitare binding primers dimero e il gene telomero e di controllo sono stati analizzati nella stessa provetta PCR per evitare ulteriori errori. La risultante misure di lunghezza dei telomeri fortemente correlato con la lunghezza dei telomeri misurata mediante analisi Southern blot di TRFs e avevano una maggiore precisione ^{15, 19, 36.} Al momento, qRT-PCR è l'unico metodo conveniente disponibile per esaminare campioni di grandi dimensioni e richiede soltanto una piccola quantità di DNA a svolgere. Una parte fondamentale di questo metodo è ampie misure di controllo della qualità, in modo che quando è fatto correttamente, questo metodo può fornire preziose informazioni comparative sulla lunghezza dei telomeri. Inoltre, questo metodo era stato adattato per l'uso oltre leucociti per misurarelunghezza dei telomeri in una varietà di differenti tessuti ^42.

Inoltre, al fine di capire meglio la biologia dietro manutenzione lunghezza dei telomeri e le interazioni tra i due effetti opposti (cioè accorciamento dei telomeri durante la replica e l'allungamento dall'enzima telomerasi), abbiamo accompagnato il metodo della lunghezza dei telomeri con un test supplementare che misura l'attività della telomerasi.

A questo scopo, abbiamo utilizzato una ripetizione telomerica protocollo di amplificazione, un saggio in vitro. Brevemente, lisato, conservata, le cellule enzimaticamente attive ripetizioni telomeriche sintetizzati su un substrato oligonucleotide utilizzando telomerasi, ed i prodotti sono stati amplificati mediante PCR in presenza di SYBR Green. I risultati sono stati poi analizzati confrontando campioni e di controllo i valori di soglia Ct. Poiché telomerasi è un enzima termosensibile, un ulteriore trattamento termico viene eseguito il controllo accanto a ciascun campione ^21.

Durante la misurazione della lunghezza dei telomeri può fornire informazioni preziose sul possibile ruolo della lunghezza dei telomeri nella fisiopatologia dell'invecchiamento e della malattia, la lunghezza dei telomeri non è una struttura statica e ulteriori informazioni per capire la funzione dei telomeri. Studi l'attività della telomerasi possono aggiungere informazioni su telomeri meccanismi di regolazione della lunghezza. Per esempio, l'attivazione controllata della telomerasi può mantenere la lunghezza dei telomeri e proliferazione cellulare, ma l'attivazione incontrollata della telomerasi può provocare il cancro. Questi due metodi poco costosi e dritto in avanti uniti ci ha fornito non solo con forti evidenze verso una relazione tra lunghezza dei telomeri e la stabilità delle cellule, ma anche ulteriori indicazioni circa i possibili meccanismi di accorciamento dei telomeri e di recupero. Con questi metodi si spera di chiarire ulteriormente la risposta della cella di invecchiamento e diversi stati di proliferazione cellulare con l'obiettivo finale di una migliore comprensione della centrale mechanisms di biologia cellulare.

Protocollo

1. Telomere Lunghezza protocollo ¹⁹

1. Estrazione del DNA

Possono essere utilizzate La maggior parte dei metodi di isolamento del DNA. Il nostro laboratorio preferisce Qiagen Kit DNeasy (# 69506) per le fonti di sangue. A seconda della fonte di DNA, come fonti di buccali o altro, può essere utilizzato un metodo di isolamento differente.

2. Primers:

Tutti i primer sono diluiti ad una concentrazione di magazzino 100pmoles/μl PCR in acqua di grado e conservati a -20 ° C fino all'utilizzo. Scorte di lavoro dei primer sono fatti freschi e vengono conservati a 20 ° C per un breve periodo di tempo (alcuni mesi). Primers standard sono stati utilizzati per telomeri e β-globina, il SCG, come descritto in O'Callaghan et al. ²⁰ .

Sequenze di primer:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Nota: I primer sono diluiti ad una concentrazione di lavoro di 10pmoles/μl, prima di aggiungere alla miscela di reazione.

3. Diluizioni seriali di DNA genomico:

Diluizioni seriali di DNA genomico per Telo e Single Copy Gene (SCG) sono creati per generare una curva standard di valore Ct per il dosaggio. Il DNA genomico è stato estratto da usato linfociti da campioni di sangue. Queste diluizioni sono creati mediante diluizione DNA con grado PCR H ₂ 0 per ogni concentrazione di un fattore di 1,68 per ottenere le due serie di diluizioni seriali attraverso lo stesso DNA genomico. Le concentrazioni iniziali sono stati ottimizzati in base a prove ed errori e potrebbe essere necessario un aggiustamento quando si usano reagenti differenti, strumenti, di DNA di altre specie, tipi cellulari e SCG utilizzati.

Nota: diluizione seriale usando DNA genomico sono fatto mescolando delicatamente e attendere almeno 15 minuti ad un'ora befori prendendo DNA per la successiva diluizione. Ogni diluizione richiede tempo per il DNA genomico a dissociarsi. Per lo stoccaggio, diluizioni seriali a lungo termine aliquote in strisce PCR per la conservazione a -80 ° C. Ogni striscia PCR viene scongelato e utilizzato una volta per evitare di congelare disgelo che possono danneggiare il DNA.

4. Installazione di reazione per RT-PCR

Strumento utilizzato: Roche480 Cycler Luce

Reattivo: Roche Luce cycler SYBR-verde

Diluire campioni di DNA di prova ad una concentrazione finale di 10 ng / mL. Testiamo la concentrazione utilizzando Nanodrop o Qubit. Abbiamo diluire ulteriormente il DNA da 10ng/μl a 5ng/μl finale. Noi non testiamo di nuovo la concentrazione.

Componenti di reazione:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0	6 pl		H20	6 pl
Telo 1	0,2 microlitri		SCG 1	0,6 microlitri
Telo 2	1,8 microlitri		SCG 2	1,4 microlitri
Rxn mix	10 microlitri		Rxn mix	10 microlitri
DNA o di diluizione in serie	2 microlitri		DNA o di diluizione in serie	2 microlitri

Nota: Master Mix è fatta senza DNA e con un eccesso del 5% al 10%.

Sia Telo e SCG si eseguono contemporaneamente sulla stessa piastra utilizzando il seguente programma. Per testare per la precisione, almeno tre repliche di ciascun campione e di controllo deve essere eseguito. Le variazioni dei primer utilizzati possono influenzare i risultati. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per lavorare come segue sul Roche480 Luce Cycler e dei nostri primer.

Indenaturare itial
10 min denaturare 95 ° C
Ciclismo
95 ° C 10 sec attesa
60 ° C 5 sec stiva
72 ° C 11 sec attesa e acquisizione singolo
Ripetere 45-55 volte come richiesto

2. Quantitativa della telomerasi Detection (QTD) Protocol (Basato su Kit QTD da Allied Biotech, Inc. N. di cat. MT3012)

Estrarre Preparazione

1. Cellule pellet o del tessuto.
2. Lavare una volta con PBS 1x.
3. Repellet e remove 1x PBS. *
4. Risospendere il pellet di cellule in 200 ml di 1 x tampone di lisi per ogni 10 ⁵ -10 ⁶ celle o 40-100 mg di tessuto.
5. Incubare in ghiaccio per 30 min.
6. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
7. Trasferire 160 microlitri della surnatante in una nuova provetta e determinare la concentrazione di proteine.
8. Aliquota e rapido congelare l'estratto residuo in ghiaccio secco / etanolo, conservare a -80 ° C.

* In tla sua condizione, telomerasi nelle cellule congelate o tessuti è stabile per almeno un anno. Quando scongelato per l'uso, immediatamente risospendere le cellule in 1 x tampone di lisi.

2.1. Testare controlli

Controllo inattivazione termica: Per ogni campione, riscaldare trattare un estratto controllo aggiuntivo incubando a 85 ° C per 10 min prima saggio di attività telomerasica.

Curva standard per il modello di controllo TSR: Eseguire Quantitative Real-Time PCR utilizzando diluizioni di TSR, un oligonucleotide con una sequenza simile a primer telomeri incluse nel kit per generare una curva standard.

1. Preparare diluizioni seriali 1:05 della concentrazione della TSR (0,5 amoles / mL) con Lysis Buffer
2. Eseguire il dosaggio standard di rilevamento della telomerasi utilizzando 1 ml di ogni diluizione TSR, tra cui la concentrazione di magazzino. Queste diluizioni possono essere conservati a 4 ° C per almeno 2 settimane.

2.2. La telomerasi Activity Assayutilizzando QTD Real-Time PCR

1. Per ogni campione, aggiungere quanto segue in un tubo di PCR o PCR a parete sottile piastra (volume totale di 25,0 ml):
   • 12,5 ml di 2 x Premix QTD
   • 1,0 ml di cellule o tessuti estratto
   • 11,5 ml di acqua PCR Qualificato
2. Mescolare accuratamente
3. Programma Real-Time PCR Detection System secondo il programma di seguito:
   - 25 ° C per 20 min (reazione telomerasi)
   - 95 ° C per 10 min (PCR fase di attivazione iniziale)
   35-40 cicli di:
   - 95 ° C per 30 sec (denaturazione)
   - 60 ° C per 30 sec (annealing)
   - 72 ° C per 30 sec (estensione)
4. Posizionare i tubi di PCR nel termociclatore e avviare il programma di ciclismo.
5. Raccogliere il ciclo soglia o valore C _T dopo la fine dei cicli. Il ciclo soglia è il ciclo con cui un aumento statisticamente significativo di ΔRn prima rilevazione.

2.3. Analisi dei dati

1. Generatcurva standard EA utilizzando le letture C _T e confrontare le attività della telomerasi.

Risultati

Un esempio di una lunghezza saggio RT-PCR quantitativa telomeri è mostrato in Figura 1. Sul pannello superiore sinistro, campioni etichettati in rosso e verde rappresentano la posizione dei soggetti testati sulla piastra a 96 pozzetti. Sul pannello superiore destro, la curva di amplificazione è dimostrato. Ogni oggetto è testato da due saggi (telomeri e singola copia del gene), che è fatto in triplicato. A causa di diverse copie di DNA prodotti nelle due saggi di individui selezionati, il numero di ...

Discussione

La lunghezza dei telomeri fornisce un marcatore cellulare unico per studiare la cellula stressati e invecchiamento e offre approfondimenti sui meccanismi di invecchiamento. Dal momento che era stato prima suggerito il suo ruolo nel processo di invecchiamento, una moltitudine di studi sono stati fatti riguardanti la lunghezza dei telomeri di età, la longevità, la malattia legata all'età, tumori, e lo stress. Per decenni, il gold standard di misura della lunghezza dei telomeri era terminale analisi dei frammenti di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516