La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

Resumen

Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Resumen

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN en los extremos de punta de los cromosomas que son diferentes en longitud y en el ser humano puede alcanzar una longitud de 15.000 pares de bases. El telómero sirve como un mecanismo de bioprotectora del cromosoma desgaste en cada división celular. En una cierta longitud, los telómeros se vuelven demasiado cortos para permitir la replicación, un proceso que puede conducir a la inestabilidad cromosómica o la muerte celular. Longitud de los telómeros está regulada por dos mecanismos opuestos: deserción y el alargamiento. Desgaste se produce a medida que cada célula se divide. En contraste, el alargamiento es parcialmente modulada por la enzima telomerasa, que añade secuencias de repetición de los extremos de los cromosomas. De esta manera, la telomerasa podría invertir posiblemente un mecanismo de envejecimiento y rejuvenece la viabilidad celular. Estos son elementos cruciales en el mantenimiento de la vida celular y se utilizan para evaluar el envejecimiento celular. En este manuscrito se describirá un método preciso, breve, sofisticado y barato para evaluar la longitud del telómero en múltiples tejidoss y especies. Este método se aprovecha de dos elementos clave, la repetición en tándem de la secuencia de los telómeros y la sensibilidad de la QRT-PCR para detectar el número de copias diferenciales de muestras ensayadas. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Introducción

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN hexámeros (TTAGGG) que se encuentran en los extremos de los cromosomas. En cada replicación celular, estos extremos de los cromosomas se acortan. Si se vuelven demasiado cortos, los cromosomas pueden sufrir fusiones telómero finales, recombinación aberrante y degradación. Por lo tanto suficiente mantenimiento de la longitud del telómero juega un papel importante en la estabilidad de los cromosomas y la protección de la célula ^38. Mantenimiento de la longitud del telómero es también crucial para genes que se encuentran cerca de los extremos de los cromosomas, ya que la replicación del ADN no puede continuar hasta el final de los cromosomas ^1-2. Por consiguiente, la prevención de acortamiento de los telómeros puede mejorar la estabilidad celular.

Numerosos estudios han informado de que la longitud de los telómeros se correlaciona con la longevidad de un organismo y el estado de enfermedad, tales como en el cáncer de ^{3-4, 5} la diabetes, y la enfermedad cardiovascular ^6,7. Además, acortamiento de los telómeros se han asociado con el exceso de estrés o unestilo de vida poco saludable ^8, tal vez mediante la promoción de un envejecimiento prematuro y muerte celular ^9. Por otro lado, algunos estudios han encontrado que no hay diferencia significativa entre la longitud de los telómeros y la longevidad y la enfermedad relacionada con la edad ^{39, 40, 41.}

Uno de los mecanismos innatos de la célula de protección de acortamiento de los telómeros es mediante la activación de su propia enzima telomerasa transcriptasa inversa (TERT). Esta enzima y su subunidad, ARN de telomerasa (TERC), un ARN no codificante, utilizan el telómero como una plantilla para añadir telómero se repite en el cromosoma termina ^10. Aunque la actividad de la telomerasa está ausente de varios tipos de células y otros mecanismos están implicados en el mantenimiento de la longitud del telómero, el aumento de actividad de la telomerasa se correlaciona con el aumento de la longitud del telómero. Activación de la telomerasa se ha establecido como uno de los mecanismos por los que las células responden a daño y el estrés y evitar la senescencia y muerte prematura. Por ejemplo, ya TElomeres se demostraron en una población de Judios Ashkenazi con excepcional vida útil ^11, las mutaciones en TERC o de TERT se han demostrado que contribuyen a la enfermedad fatal ^12, y la regulación epigenética de la telomerasa se ​​ha demostrado que tienen un efecto sobre la enfermedad relacionada con la edad ^13. Desde su descubrimiento, la longitud del telómero se ha propuesto como un biomarcador para el estado de salud en diversos modelos animales, así como en los seres humanos, pero estos primeros estudios eran difíciles de replicar ampliamente debido a que el método utilizado fue tedioso, largo y costoso. En 2002 y ajustado aún más en 2009, Cawthon propuso y demostró un nuevo protocolo, preciso, rápido y sencillo basado en la PCR para evaluar la longitud de los telómeros y de investigar más a fondo su papel en diversos aspectos de la biología celular, el envejecimiento y la enfermedad ^19.

La elección del método de medición del telómero correcto para un estudio es esencial. Actualmente, existen varios métodos utilizados para medir la longitud de los telómeros, cada uno con su propiaventajas y desventajas. Tradicionalmente, la longitud de los telómeros se mide usando análisis de transferencia Southern de los fragmentos de restricción terminales (TRFs), que implica: a. la digestión del ADN con enzimas de restricción que no cortan en el telómero se repite con el fin de obtener los TRF, b. Southern Blot de estos TRF se realiza mediante la determinación de la longitud media TRF utilizando una sonda telomérica ^{14, 37.} Aunque este método es muy preciso con un pequeño coeficiente de variación, es una medida directa, y puede ser ventajoso para la medición de distribución de la longitud, el análisis TRF es costoso, mano de obra intensiva y requiere al menos 3 g de ADN. Este método también es insensible a los telómeros cortos y determinación de la longitud puede ser confundida por ADN subtelomérico, que puede ser detectada por la sonda por la (TTAGGG) n igual que las secuencias que contienen ^{15, 42.}

Otro método de alta precisión en la medición de la longitud del telómero es Individual telómeros Análisis Longitud Elongación (ESTELA), una singlMétodo E molécula basado en la PCR que sólo requiere una pequeña cantidad de ADN. En este método, se hacen cebadores para reconocer el G rico en voladizo en el extremo de los cromosomas y para unirse a una secuencia subtelomérico única en un cromosoma, que amplifica el telómero de un cromosoma específico. La amplificación resultante es entonces visualizado por Southern Blot. Este método tiene la ventaja de ser muy preciso y es capaz de detectar valores atípicos telómeros cortos ^16. Por desgracia, ya que no todos los cromosomas tienen extremos G-ricos y una secuencia subtelomérica utilizable, longitud de los telómeros se puede medir sólo en los cromosomas específicos y estas medidas no puede representar la longitud de los telómeros en la celda ^15.

Otro método que se ha practicado es el uso de ácido nucleico peptídico (PNA) sondas para detectar la longitud del telómero. Florescence cuantitativa hibridación in situ (Q-FISH) permite visualizar los telómeros durante la metafase, donde el staining de los telómeros con una sonda de ANP en proporción a su tamaño permite la comparación de los telómeros entre cromosomas específicos. Aunque este método también se puede utilizar para las células en interfase, aquí la longitud de los telómeros de los cromosomas distintos puede no ser detectado, lo que introduce una limitación en la medición de longitud de los telómeros en las células senescentes o con poca frecuencia dividiendo ^17. PEZ de flujo en su lugar utiliza la citometría de flujo y es actualmente el método más sensible para la medición de la longitud del telómero de células de la sangre en el entorno clínico, pero requiere técnicos altamente cualificados ^18.

Actualmente, el método estándar para medir la longitud media de los telómeros en nuestro laboratorio se aprovecha de la precisión, la sensibilidad, y la facilidad de PCR cuantitativa en tiempo real. Este método fue posible para la medición de la longitud del telómero por el desarrollo de cebadores novedosos que evitar la síntesis de productos de dímero de cebadores derivados, que de otro modo se han producido en comostándar ensayo debido a la naturaleza repetitiva de los telómeros. Para este ensayo, la medición de la longitud de los telómeros está representada por la relación T / S, el número de copia repetida de los telómeros para el número de genes de copia única. Puesto que existe una relación directamente proporcional entre la longitud de los telómeros y el número de cebadores telómero marcado que se une al ADN durante las etapas iniciales de la PCR, la relación T / S es directamente proporcional a la longitud de los telómeros. La relación T / S se mide mediante la comparación de la diferencia en el Ct, el número de ciclo fraccional al que la muestra ha acumulado fluorescencia cruza un umbral que es varias desviaciones estándar por encima de la línea de base de fluorescencia, entre las muestras con cebadores telómero y SCG cebadores ^19. Este método ha sido criticado por su medición indirecta de la longitud de los telómeros, que puede conducir a mediciones inexactas, por ejemplo, en el caso del cromosoma duplicaciones o variaciones del número de copia ^15. Además, la comparación entre estudios es a menudo difficult, pero estándar oligómeros han sido desarrollados para medir la longitud de los telómeros absoluta ^20. Este método fue fomentada mejorado por Cawthon, utilizando un ensayo qPCR multiplex monocromo. En este ensayo, la PCR se realizó a temperaturas más bajas para los primeros pocos ciclos para evitar la unión del cebador-dímero y el gen de los telómeros y el control se analizaron en el mismo tubo de PCR para evitar un mayor error. Las mediciones de la longitud del telómero resultantes fuertemente correlacionada con la longitud de los telómeros se mide por análisis de transferencia Southern de los TRF y tenía una mayor precisión de ^{15, 19, 36.} Por el momento, QRT-PCR es el único método práctico disponible para probar muestras de gran tamaño y sólo requiere una pequeña cantidad de ADN para llevar a cabo. Una parte fundamental de este método es medidas generales de control de calidad, por lo que cuando se hace correctamente, este método puede proporcionar una valiosa información comparativa acerca de la longitud del telómero. Además, este método ha sido adaptado para su uso más allá de los leucocitos para medirlongitud de los telómeros en una variedad de diferentes tejidos ^42.

Además, con el fin de entender mejor la biología detrás de mantenimiento de la longitud del telómero y las interacciones entre los dos efectos opuestas (es decir, acortamiento de los telómeros durante la replicación y la elongación por la enzima telomerasa), acompañamos el método de longitud de los telómeros con un ensayo adicional que mide la actividad de la telomerasa.

Para este propósito, se utilizó un Protocolo de Amplificación de repetición telomérica, un ensayo in vitro. Brevemente, se lisaron, conserva, las células sintetizan enzimáticamente activas repeticiones teloméricas en un sustrato de oligonucleótido usando la telomerasa, y los productos se amplificaron mediante PCR en presencia de SYBR Green. Los resultados se analizaron a continuación mediante la comparación de la muestra y de control de los valores de umbral Ct. Dado que la telomerasa es una enzima sensible al calor, un calor adicional tratado de control se ejecuta junto a cada muestra ^21.

Mientras que la medición de la longitud del telómero puede proporcionar información valiosa sobre la posible función de la longitud del telómero en la fisiopatología de la enfermedad y el envejecimiento, la longitud del telómero no es una propiedad estática y más información para comprender la función del telómero. Estudios de la actividad telomerasa puede añadir información sobre los mecanismos de regulación de la longitud del telómero. Por ejemplo, la activación controlada de la telomerasa puede mantener la longitud de los telómeros y la proliferación celular, pero la activación incontrolada de la telomerasa puede resultar en cáncer. Estos dos métodos de bajo costo hacia delante y recto combinados nos proporcionó no sólo con la evidencia más fuerte hacia una relación entre la longitud de los telómeros y la estabilidad celular, sino también una mayor comprensión de los posibles mecanismos de acortamiento de los telómeros y la recuperación. Con estos métodos esperamos para dilucidar aún más la respuesta de la célula al envejecimiento y varios estados de proliferación celular con el objetivo final de una mejor comprensión de la central de mechanisms de la biología celular.

Protocolo

1. Protocolo de la longitud del telómero ¹⁹

1. Aislamiento de ADN

La mayoría de los métodos de aislamiento de ADN se pueden usar. Nuestro laboratorio prefiere Qiagen DNeasy kit (# 69506) para las fuentes de sangre. Dependiendo de la fuente de ADN, tales como bucales u otras fuentes, un método de aislamiento diferente puede ser utilizado.

2. Los cebadores:

Todos los cebadores se diluyen a una concentración de stock de 100pmoles/μl en agua de grado PCR y se almacenaron a -20 ° C hasta que sea necesario. Las cepas de trabajo de cebadores están recién hechas y se almacenan a 20 ° C durante un corto período de tiempo (algunos meses.) Cebadores estándar se utilizaron para los telómeros y la β-globina, la SCG, como se describe en O'Callaghan et al. ²⁰ .

Primer secuencias:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Nota: Los cebadores se diluyeron a una concentración de trabajo de 10pmoles/μl, antes de añadir a la mezcla de reacción.

3. Diluciones seriadas de ADN genómico:

Diluciones seriadas de ADN genómico de Telo y copia única del gen (SCG) se crean para generar una curva de valor Ct estándar para el ensayo. El ADN genómico utilizado se extrajo a partir de linfocitos de muestras de sangre. Estas diluciones se crean mediante la dilución de ADN con PCR de grado ₂ H 0 para cada concentración por un factor de 1,68 para producir las dos series de diluciones en serie utilizando el mismo ADN genómico. Las concentraciones de partida se han optimizado sobre la base de ensayo y error, y pueden necesitar ser ajustado cuando el uso de diferentes reactivos, instrumentos, el ADN de otras especies, tipos de células, y SCG utilizados.

Nota: La dilución en serie usando ADN genómico se hace mezclando suavemente y esperar al menos 15 minutos hasta una hora antvolver a tomar ADN para la siguiente dilución. Cada dilución requiere tiempo para el ADN genómico para disociar. Para almacenamiento, diluciones en serie a largo plazo alícuotas en tiras de PCR para el almacenamiento a -80 ° C. Cada tira de PCR se descongela y se usa una vez para evitar los ciclos de congelación y descongelación que pueden dañar el ADN.

4. Configuración de reacción para RT-PCR

Instrumento utilizado: Roche480 Light termociclador

Reactivo: Roche Light termociclador SYBR verde-

Diluir las muestras de ADN de prueba a una concentración final de 10 ng / l. Probamos concentración utilizando Nanodrop o Qubit. Nos diluir el ADN de 10ng/μl a 5ng/μl final. No probamos la concentración de nuevo.

Componentes de reacción:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0	6 l		H20	6 l
Telo 1	0,2 l		SCG 1	0,6 l
Telo 2	1,8 l		SCG 2	1,4 l
Rxn mezcla	10 l		Rxn mezcla	10 l
ADN o dilución en serie	2 l		ADN o dilución en serie	2 l

Nota: Master Mix se hace sin ADN y con un exceso de 5% a 10%.

Tanto Telo y el CGS se ejecutan a la vez en la misma placa utilizando el siguiente programa. Para la prueba de precisión, al menos tres repeticiones de cada muestra y control se debe ejecutar. Las variaciones de los cebadores utilizados pueden afectar los resultados. El protocolo ha sido optimizado para trabajar como sigue en el Roche480 Light Cycler y nuestros cebadores.

Endesnaturalizan itial
10 min 95 ° C desnaturalizan
Ciclismo
95 ° C 10 seg bodega
60 ° C 5 sec bodega
72 ° C 11 seg retención y adquisición única
Repita 45 a 55 veces como sea necesario

2. Detección cuantitativa telomerasa (QTD) Protocolo (Basado en Kit QTD por Allied Biotech, Inc. gato. No. MT3012)

Extraer Preparación

1. Precipitar las células o tejidos.
2. Lavar una vez con PBS 1x.
3. Repellet y eliminar 1x PBS. *
4. Resuspender el sedimento celular en 200 l de 1 x tampón de lisis por cada 10 ⁵ -10 ⁶ células o 40-100 mg de tejido.
5. Incubar en hielo durante 30 min.
6. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
7. Transferir 160 l del sobrenadante en un tubo nuevo y determinar la concentración de proteína.
8. Alícuotas y congelar rápidamente el extracto remanente en hielo seco / etanol, almacenar a -80 ° C.

* En el tsu condición, la telomerasa en las células o tejidos congelados es estable durante al menos un año. Cuando se descongelan para su uso, volver a suspender las células inmediatamente en 1 x tampón de lisis.

2.1. Controles de Ensayo

Control de inactivación por calor: Para cada muestra, el tratamiento térmico de un extracto de control adicional mediante la incubación a 85 ° C durante 10 min antes del ensayo de actividad de la telomerasa.

Curva estándar para la plantilla de control TSR: Efectuar la PCR cuantitativa en tiempo real usando diluciones de TSR, un oligonucleótido con una secuencia similar a los telómeros cebadores incluidos en el kit para generar una curva estándar.

1. Preparar diluciones seriadas 1:05 de la concentración TSR almacén (0,5 Amoles / l) con tampón de lisis
2. Realice la telomerasa ensayo estándar de detección por medio de 1 l de cada dilución TSR, incluyendo la concentración de valores. Estas diluciones se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos 2 semanas.

2.2. Ensayo de actividad de la telomerasautilizando QTD PCR en tiempo real

1. Para cada muestra, añada lo siguiente a un tubo de PCR o de pared delgada placa de PCR (volumen total de 25,0 l):
   • 12,5 l de 2 x Premix QTD
   • 1,0 l de células o extracto de tejido
   • 11,5 l de PCR Agua Calificado
2. Mezclar bien
3. Programa de Sistemas de Tiempo Real de detección PCR de acuerdo con el siguiente programa:
   - 25 ° C durante 20 min (reacción telomerasa)
   - 95 ° C durante 10 min (PCR paso de activación inicial)
   35-40 ciclos de:
   - 95 ° C durante 30 segundos (desnaturalización)
   - 60 ° C durante 30 segundos (hibridación)
   - 72 ° C durante 30 segundos (extensión)
4. Coloque los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclismo.
5. Recoger el ciclo umbral o valor C _T después de terminar los ciclos. El ciclo umbral es el ciclo en el que se detecta un aumento estadísticamente significativo de ARn primero.

2.3. Análisis de Datos

1. Generatea curva estándar usando las lecturas de _T C y comparar la actividad telomerasa.

Resultados

Un ejemplo de un ensayo de QRT-PCR longitud de los telómeros se muestra en la Figura 1. En el panel superior izquierdo, muestras marcadas en rojo y verde representan la ubicación de los sujetos evaluados en la placa de 96 pocillos. En el panel superior derecho, se demuestra la curva de amplificación. Cada tema se analiza en dos ensayos (Telómeros y copia única del gen), que se realiza por triplicado. Debido a los diferentes números de copias de ADN producidos en los dos ensayos de los individuos s...

Discusión

Longitud de los telómeros proporciona un marcador celular única para estudiar la célula estresada y el envejecimiento y ofrece una visión de los mecanismos de envejecimiento. Desde su papel en el envejecimiento de la primera se había sugerido, una multitud de estudios se han realizado sobre la longitud del telómero a la edad, la longevidad, las enfermedades relacionadas con la edad, el cáncer y el estrés. Durante décadas, el patrón oro de la medición de la longitud del telómero fue el análisis de los fragme...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516