La longueur des télomères et de la télomérase activité; Une Yin et Yang de la sénescence cellulaire

Résumé

Une méthode précise, courte, sophistiqué et pas cher est décrit qui évalue la longueur des télomères dans de nombreux tissus et les espèces à l'aide de qRT-PCR. En outre, nous allons décrire un test simple pour évaluer l'activité de la télomérase comme un test de la colonne vertébrale complémentaire pour la longueur des télomères.

Résumé

Les télomères sont des séquences répétitives d'ADN à l'extrémité extrémités des chromosomes qui sont diversifiés en longueur et en l'homme peut atteindre une longueur de 15.000 paires de bases. Le télomère est un mécanisme bioprotectrice d'attrition des chromosomes à chaque division cellulaire. À une certaine longueur, les télomères deviennent trop courts pour permettre la réplication, un processus qui peut conduire à une instabilité chromosomique ou la mort cellulaire. La longueur des télomères est régie par deux mécanismes opposés: l'attrition et l'allongement. Attrition se divise comme chaque cellule. En revanche, l'élongation est partiellement modulé par l'enzyme télomérase, qui ajoute des séquences répétitives à l'extrémité des chromosomes. De cette façon, la télomérase pourrait inverser un mécanisme de vieillissement et rajeunit la viabilité cellulaire. Ce sont des éléments cruciaux pour le maintien de la vie cellulaire et sont utilisés pour évaluer le vieillissement cellulaire. Dans ce manuscrit, nous allons décrire un court méthode sophistiquée et pas cher précis, afin d'évaluer la longueur des télomères dans les tissus multiples et des espèces. Ce procédé tire parti de deux éléments principaux, l'unité de répétition en tandem de la séquence de télomère et de la sensibilité de la qRT-PCR pour détecter des nombres de copies différentielles des échantillons testés. En outre, nous allons décrire un test simple pour évaluer l'activité de la télomérase comme un test de la colonne vertébrale complémentaire pour la longueur des télomères.

Introduction

Les télomères sont des séquences répètent ADN hexamères (TTAGGG) trouvés à l'extrémité des chromosomes. Dans chaque réplication cellulaire, ces extrémités des chromosomes sont raccourcies. S'ils deviennent trop courts, les chromosomes peuvent subir des fusions télomères finaux, recombinaison aberrant, et la dégradation. Ainsi suffisante entretien de la longueur des télomères joue un rôle majeur dans la stabilité des chromosomes et la protection de la cellule ^38. Entretien de la longueur des télomères est également crucial pour les gènes trouvés près de l'extrémité des chromosomes, car la réplication de l'ADN ne peut pas continuer jusqu'à la fin de chromosomes ^1-2. Par conséquent, la prévention de raccourcissement des télomères peut améliorer la stabilité de la cellule.

De nombreuses études ont rapporté que la longueur des télomères est en corrélation avec la longévité de l'organisme et de l'état pathologique, comme dans le cancer ^{3-4, 5} diabète et les maladies cardiovasculaires ^6,7. En outre, les télomères raccourcis ont été associés à un stress excessif ou unmode de vie malsain ^8, peut-être en favorisant le vieillissement prématuré des cellules et la mort ^9. D'autre part, certaines études ont montré qu'il n'y a pas de différence significative entre la longueur des télomères et la longévité et l'âge liés à la maladie ^{39, 40, 41.}

Un des mécanismes innés de la cellule de protection contre le raccourcissement des télomères est en activant son propre enzyme télomérase transcriptase inverse (TERT). Cette enzyme et son unité, la télomérase ARN (TERC), un ARN non codant, utilisez le télomère comme un modèle pour ajouter répète télomères extrémités des chromosomes ^10. Bien que l'activité de la télomérase est absent de plusieurs types de cellules et d'autres mécanismes sont impliqués dans le maintien de la longueur des télomères, l'augmentation de l'activité de la télomérase est corrélée à une augmentation de la longueur des télomères. activation de la télomérase a été établi comme l'un des mécanismes par lesquels les cellules répondent aux dommages et le stress et éviter la sénescence prématurée et la mort. Par exemple, plus telomeres ont été démontrées dans une population de juifs ashkénazes avec exceptionnelle durée de vie ^11, ont montré des mutations dans TERC ou TERT de contribuer à la maladie mortelle ^12, et la régulation épigénétique de la télomérase a été montré pour avoir un effet sur ​​les maladies liées à l'âge ^13. Depuis sa découverte, la longueur des télomères a été proposé comme un biomarqueur de l'état de santé dans divers modèles animaux ainsi que chez l'homme, mais ces premières études étaient difficiles à reproduire largement parce que la méthode utilisée était fastidieux, long et coûteux. En 2002 et plus à l'écoute en 2009, Cawthon proposé et fait preuve d'un nouveau protocole, précis, rapide et simple PCR base pour évaluer la longueur des télomères et approfondir son rôle dans divers aspects de la biologie cellulaire, le vieillissement et la maladie ^19.

Le choix de la méthode de mesure des télomères correct pour une étude est essentielle. Actuellement, il existe diverses méthodes utilisées pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec sa propreavantages et des inconvénients. Traditionnellement, la longueur des télomères est mesurée en utilisant une analyse par transfert de Southern de fragments de restriction terminaux (TRF), ce qui implique: a. digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction qui ne coupent pas dans les répétitions des télomères afin d'obtenir TRF, b. Southern Blot de ces TRF se fait par la détermination de la durée moyenne de la Fondation à l'aide d'une sonde télomérique ^{14, 37.} Bien que cette méthode est très précise avec un petit coefficient de variation est une mesure directe, et peut être avantageuse pour la mesure de la distribution de la longueur, l'analyse TRF est coûteuse, laborieuse et nécessite au moins 3 pg d'ADN. Cette méthode est également insensible aux télomères courts et la détermination de la longueur peut être confondue par l'ADN subtélomérique, qui peut être détectée par la sonde en raison de la (TTAGGG) n comme séquences qu'elles contiennent ^{15, 42.}

Une autre méthode très précise pour mesurer la longueur des télomères est simple télomères Allongement Longueur Analyse (STELA), une single molécule méthode basée sur la PCR qui ne nécessite qu'une petite quantité d'ADN. Dans cette méthode, les amorces sont faits pour reconnaître le G riche en porte à faux à l'extrémité des chromosomes et de se lier à une séquence subtélomérique unique sur un chromosome, qui amplifie le télomère d'un chromosome particulier. L'amplification résultante est alors visualisée par Southern Blot. Cette méthode a l'avantage d'être très précis et est capable de détecter des télomères courts aberrantes ^16. Malheureusement, étant donné que tous les chromosomes ont des extrémités riches en G et une séquence subtélomérique utilisable, la longueur des télomères ne peut être mesurée sur les chromosomes spécifiques et ces mesures peuvent ne pas représenter la longueur de l'ensemble des télomères dans la cellule ^15.

Une autre méthode qui a été pratiquée est l'utilisation d'acide nucléique peptidique (PNA) des sondes pour détecter la longueur des télomères. Fluorescence Quantitative hybridation in situ (Q-FISH) permet de visualiser les télomères pendant la métaphase, où le stAining des télomères avec une sonde PNA en proportion de leur taille permet la comparaison entre des télomères des chromosomes spécifiques. Bien que cette méthode peut également être utilisé pour les cellules en interphase, voici la longueur des télomères des chromosomes distincts ne peut pas être détectée, ce qui introduit une limitation lorsque l'on mesure la longueur des télomères dans les cellules sénescentes ou diviser rarement ^17. FISH Flow utilise plutôt la cytométrie de flux et est actuellement la méthode la plus sensible pour mesurer la longueur des télomères des cellules sanguines dans le cadre clinique, mais nécessite des techniciens hautement qualifiés ^18.

Actuellement, la méthode standard pour mesurer la longueur moyenne des télomères dans notre laboratoire tire profit de la précision, la sensibilité et la facilité de la PCR quantitative en temps réel. Cette méthode a été rendu possible pour mesurer la longueur des télomères par le développement de nouvelles amorces qui permettent d'éviter la synthèse des amorces produits dimères dérivés, qui auraient autrement été produit en tant quetest de tandard en raison de la nature répétitive de télomères. Pour ce test, la mesure de la longueur des télomères est représentée par le rapport T / S, le nombre de répétition de copie des télomères au numéro de gène à copie unique. Comme il existe une relation de proportionnalité directe entre la longueur des télomères et le nombre d'amorces télomères marqué se liant à l'ADN au cours des premiers stades de la PCR, le ratio T / S est directement proportionnelle à la longueur des télomères. Le rapport T / S est mesuré en comparant la différence de Ct, le nombre de cycles fractionnaire à laquelle l'échantillon a accumulé floraison franchit un seuil qui est plusieurs écarts types au-dessus de la fluorescence de base, entre les échantillons avec des amorces télomères et SCG amorces ^19. Cette méthode a été critiquée pour sa mesure indirecte de la longueur des télomères, ce qui peut conduire à des erreurs de mesure, par exemple, dans le cas des duplications de chromosomes ou des variations du nombre de copies ^15. En outre, la comparaison entre les études est souvent difficult, mais norme oligomères ont été développés pour mesurer la longueur des télomères absolue ^{de 20.} Cette méthode a été favorisé amélioré par Cawthon, en utilisant une analyse de qPCR multiplex monochrome. Dans cet essai, le PCR a été effectuée à des températures plus basses pour les premiers cycles d'éviter contraignant dimères d'amorce et le gène de télomère et de contrôle ont été analysés dans le même tube PCR pour éviter de nouvelles erreurs. Les mesures de la longueur des télomères qui en résultent fortement corrélée avec la longueur des télomères mesurée par analyse de transfert de Southern de TRF et a eu une plus grande précision ^{15, 19, 36.} À l'heure actuelle, qRT-PCR est la seule méthode pratique disponible pour tester les échantillons de grande taille et ne nécessite qu'une petite quantité d'ADN à réaliser. Un élément essentiel de cette méthode est des mesures globales de contrôle de qualité, de sorte que quand c'est fait correctement, cette méthode peut fournir des informations comparatives précieuses sur la longueur des télomères. En outre, cette méthode a été adaptée pour une utilisation au-delà de leucocytes pour mesurerla longueur du télomère dans une variété de différents tissus ^42.

En outre, afin de mieux comprendre la biologie derrière entretien de la longueur des télomères et les interactions entre les deux effets opposés (ie le raccourcissement des télomères lors de la réplication et de l'allongement de l'enzyme télomérase), nous avons accompagné la méthode de la longueur des télomères avec un essai supplémentaire qui mesure l'activité de la télomérase.

Pour ce faire, nous avons utilisé un protocole d'amplification de répétition télomérique, un test in vitro. En bref, lysées, préservée, les cellules à activité enzymatique synthétisés répétitions télomériques sur un substrat oligonucléotide en utilisant la télomérase, et les produits ont été amplifiés par PCR en présence de SYBR Green. Les résultats ont ensuite été analysées en comparant les échantillons et contrôle des valeurs seuils ct. Etant donné que la télomérase est une enzyme sensible à la chaleur, traitée commande une chaleur supplémentaire est dirigé à côté de l'échantillon ^21.

En mesurant la longueur des télomères peut fournir des informations précieuses sur le rôle possible de la longueur des télomères dans la physiopathologie du vieillissement et de la maladie, la longueur des télomères n'est pas une propriété statique et plus d'informations sont nécessaires pour comprendre la fonction des télomères. études d'activité de télomérase peuvent ajouter des informations sur les mécanismes de régulation de la longueur des télomères. Par exemple, l'activation contrôlée de la télomérase peut maintenir la longueur du télomère et de la prolifération cellulaire, mais l'activation non contrôlée de la télomérase peut entraîner un cancer. Ces deux méthodes terme peu coûteux et simple combinée nous a fourni non seulement avec des preuves plus solides vers une relation entre la longueur des télomères et la stabilité de la cellule, mais aussi de mieux cerner les mécanismes possibles de raccourcissement des télomères et la récupération. Avec ces méthodes, nous espérons élucider la réponse de la cellule au vieillissement et à divers états de la prolifération cellulaire dans le but ultime d'une meilleure compréhension de la mechanis centralms de la biologie cellulaire.

Protocole

1. Télomères Protocole de longueur ¹⁹

1. isolement de l'ADN

La plupart des méthodes d'isolement de l'ADN peuvent être utilisés. Notre laboratoire préfère Kit DNeasy Qiagen (# 69506) pour les sources de sang. Selon l'origine de l'ADN, tels que les sources buccales ou autre, une méthode d'isolement différent peut être utilisé.

2. Primaires:

Toutes les amorces sont diluées à une concentration du stock de 100pmoles/μl dans l'eau PCR grade et conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation. Stocks d'exploitation d'amorces sont frais et sont stockés à 20 ° C pendant une courte période de temps (quelques mois). Amorces standards ont été utilisés pour les télomères et β-globine, le SCG, comme décrit dans O'Callaghan et al. ²⁰ .

Les séquences des amorces:
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-CTACC-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Note: Les amorces sont diluées à une concentration de travail de 10pmoles/μl, avant d'ajouter au mélange réactionnel.

3. Dilution en série de l'ADN génomique:

Dilutions en série de l'ADN génomique pour Telo et seul gène de copie (SCG) sont créés pour générer une courbe de valeur Ct standard pour le dosage. L'ADN génomique utilisé a été extrait à partir de lymphocytes provenant d'échantillons sanguins. Ces dilutions sont créées en diluant l'ADN par PCR de qualité H ₂ 0 pour chaque concentration par un facteur de 1,68, pour conduire aux deux séries de dilutions en série en utilisant le même ADN génomique. Les concentrations de départ ont été optimisés en fonction de tâtonnements et peuvent avoir besoin d'être ajustée en utilisant différents réactifs, instruments et l'ADN d'autres espèces, les types cellulaires et SCG utilisés.

Note: dilution en série en utilisant l'ADN génomique sont fabriqués en mélangeant doucement et attendre au moins 15 minutes à une heure befonouveau prélèvement de l'ADN pour la dilution suivante. Chaque dilution nécessite du temps pour l'ADN génomique de dissocier. Pour le stockage, aliquotes des dilutions en série à long terme en bandes PCR pour le stockage à -80 ° C. Chaque bande PCR est décongelé et utilisé qu'une seule fois pour éviter les cycles de gel-dégel qui peuvent endommager l'ADN.

4. installation de réaction pour la RT-PCR

Instrument utilisé: Roche480 Cycler Light

Réactif: Roche Lumière cycleur SYBR-green

Diluer les échantillons d'ADN d'essai à une concentration finale de 10 ng / pl. Nous testons concentration en utilisant Nanodrop ou qubit. Nous diluer l'ADN de 10ng/μl à 5ng/μl final. Nous ne testons à nouveau concentration.

composants de la réaction:

TELO	1x		SCG	1x
H 2 0	6 pi		H20	6 pi
Telo 1	0,2 pl		SCG 1	0,6 pl
Telo 2	1,8 pl		SCG 2	1,4 pl
Rxn mélange	10 pl		Rxn mélange	10 pl
ADN ou d'une dilution en série	2 pl		ADN ou d'une dilution en série	2 pl

Note: Master Mix est faite sans l'ADN et avec un excès de 5% à 10%.

Les deux Telo et SCG sont exécutés sur la même plaque en utilisant le programme suivant. Pour tester la précision, au moins trois répétitions de chaque échantillon et de contrôle doit être exécuté. Variations dans les amorces utilisées peuvent affecter les résultats. Notre protocole a été optimisé pour fonctionner comme suit sur le Roche480 Cycler-clair et nos amorces.

Endénaturent itial
10 min dénaturent 95 ° C
Cyclisme
95 ° C 10 sec attente
60 ° C 5 sec attente
72 ° C 11 sec attente et acquisition unique
Répétez de 45 à 55 fois que nécessaire

2. La télomérase détection quantitative (QTD) protocole (Basé sur Kit QTD par Allied Biotech, Inc. No de cat. MT3012)

Extrait Préparation

1. Sédimenter les cellules ou les tissus.
2. Laver une fois avec PBS 1x.
3. Repellet et supprimer 1x PBS. *
4. Reprendre le culot cellulaire dans 200 pi de 1 x tampon de lyse pour 10 ⁵ -10 ⁶ cellules ou 40-100 mg de tissu.
5. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
6. Isoler l'échantillon à 12000 g pendant 30 min à 4 ° C.
7. Transférer 160 ul du surnageant dans un nouveau tube et déterminer la concentration en protéines.
8. Aliquote et rapide geler l'extrait restant sur la glace sèche / éthanol, conserver à -80 ° C.

* En tson état de santé, la télomérase dans les cellules ou les tissus congelés est stable pendant au moins un an. Lors de la décongélation à l'emploi, remettre en suspension les cellules immédiatement dans 1 x tampon de lyse.

2.1. Contrôles d'analyse

contrôle d'inactivation par la chaleur: Pour chaque échantillon, traiter thermiquement un extrait de commande supplémentaires par incubation à 85 ° C pendant 10 min avant le dosage de l'activité télomérase.

Courbe standard de modèle de contrôle TSR: Effectuez PCR quantitative en temps réel en utilisant des dilutions de TSR, un oligonucléotide avec une séquence similaire à amorces télomères fournies avec le kit de générer une courbe standard.

1. Préparer 01:05 dilutions en série de la concentration de TSR boursier (0,5 Amoles / pl) avec le tampon de lyse
2. Effectuez le test standard de détection de la télomérase en utilisant 1 ul de chaque dilution de TSR, y compris la concentration des stocks. Ces dilutions peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins 2 semaines.

2.2. Activité télomérase Assayutilisant QTD PCR en temps réel

1. Pour chaque échantillon, ajouter ce qui suit dans un tube PCR ou plaque PCR à paroi mince (volume total 25,0 pi):
   • 12,5 ul de 2 x QTD Premix
   • 1,0 ul de cellules ou un extrait de tissu
   • 11,5 pi d'eau PCR qualifié
2. Mélanger soigneusement
3. Programme des systèmes de détection par PCR en temps réel selon le programme ci-dessous:
   - 25 ° C pendant 20 min (réaction de télomérase)
   - 95 ° C pendant 10 minutes (étape d'activation initiale PCR)
   35-40 cycles de:
   - 95 ° C pendant 30 secondes (dénaturation)
   - 60 ° C pendant 30 s (recuit)
   - 72 ° C pendant 30 s (extension)
4. Placez tubes PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme de cyclisme.
5. Recueillir le cycle de seuil ou la valeur C _T après la fin des cycles. Le cycle de seuil est le cycle au cours de laquelle une augmentation statistiquement significative de ARn est tout d'abord détecté.

2.3. Analyse des données

1. Generatcourbe standard ch en utilisant les _T lectures C et comparer l'activité de la télomérase.

Résultats

Un exemple d'un dosage des télomères de longueur qRT-PCR est illustré à la figure 1. Sur le panneau en haut à gauche, les échantillons marqués en rouge et vert représentent l'emplacement des sujets testés sur la plaque de 96 puits. Sur le panneau en haut à droite, la courbe d'amplification est démontrée. Chaque objet est testé par deux essais (télomères et unique copie du gène), qui se fait en triple. En raison de différents nombres de copies d'ADN produites dans les deu...

Discussion

La longueur des télomères fournit un marqueur cellulaire unique d'étudier la cellule stressée et vieillissement et offre un aperçu sur les mécanismes du vieillissement. Depuis son rôle dans le vieillissement avait d'abord été suggéré, une multitude d'études ont été faites concernant la longueur des télomères à l'âge, la longévité, la maladie liée à l'âge, les cancers et le stress. Pendant des décennies, l'étalon-or de mesures de la longueur des télomères était l'an...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516