Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения

Резюме

Точные, короткие, сложные и дешевый способ описан, который оценивает длину теломер во многих тканях и видам использования Qrt-PCR. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Аннотация

Теломеры повторяющихся последовательностей ДНК на конце концов хромосом, которые разнообразны по длине и в организме человека может достигать в длину 15 000 пар оснований. Теломер служит биозащитные механизм хромосомы истощение в каждом делении клетки. В определенной длины, теломеры становятся слишком короткими, чтобы репликация, процесс, который может привести к хромосомной нестабильности или гибель клеток. Длина теломер регулируется двумя противоположными механизмами: истощение и удлинения. Истощение происходит в каждом делении клетки. В противоположность этому, удлинение частично модулированный с помощью фермента теломеразы, который добавляет повторяющихся последовательностей на концах хромосом. Таким образом, теломераза, возможно обратное механизма старения и омолаживает жизнеспособности клеток. Они играют ключевую роль в поддержании жизни клетки и используются для оценки клеточного старения. В этой рукописи мы опишем точные, короткие, сложные и дешевый метод оценки длины теломеров в различных тканяхс и видов. Этот метод использует два основных элемента, тандемных повторов теломер последовательности и чувствительность QRT-PCR для обнаружения дифференциального числа копий испытуемых образцов. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Введение

Теломеры повторяющиеся ДНК гексамер (TTAGGG) последовательности, найденные на концах хромосом. В каждой клетке репликации, эти концы хромосом укорачиваются. Если они становятся слишком короткими, хромосомы могут подвергаться теломер слияний конца, аберрантными рекомбинации и деградации. Таким образом достаточную длину теломер обслуживания играет важную роль в обеспечении стабильности хромосом и клеточной защиты ^38. Длина теломер также имеет решающее значение для генов, найденных вблизи концов хромосом, так как репликация ДНК не может продолжаться до самого конца хромосом ^1-2. Следовательно, предотвращение укорочения теломер клетка может улучшить стабильность.

Многочисленные исследования показали, что длина теломер коррелирует с долговечность организма и болезненное состояние, например, в ^3-4 рак, диабет ^5, а также сердечно-сосудистые заболевания ^6,7. Кроме того, укороченные теломеры были связаны с чрезмерным напряжением илинездоровый образ жизни ^8, возможно, путем поощрения преждевременного старения и гибели клеток ^9. С другой стороны, некоторые исследования показали, что нет никакой существенной разницы между длиной теломер и долголетием и возрастных заболеваний связаны ^{39, 40, 41.}

Один из врожденные механизмы клетки защиты от укорочение теломер является путем активации фермента своя теломеразы обратной транскриптазы (трет). Этот фермент и его субъединицы теломеразы РНК (TERC), некодирующих РНК, используйте теломер в качестве шаблона для добавления теломер повторений, чтобы концы хромосом ^10. Хотя активность теломеразы отсутствует из нескольких типов клеток и других механизмов, которые участвуют в поддержании теломер длину, увеличение теломеразной активности коррелирует с увеличением длины теломеры. Активация теломеразы было установлено как один из механизмов, посредством которых клетки реагируют на повреждения и стресс и предотвратить преждевременное старение и смерть. Например, те большеlomeres были продемонстрированы в популяции евреев-ашкенази с исключительной продолжительностью жизни ^11, мутации в TERC или трет было показано, что вклад в смертельной болезни ¹² и эпигенетической регуляции теломеразы как было показано, влияют на возрастных заболеваний ^13. С момента своего открытия, длина теломер была предложена в качестве биомаркеров для состояния здоровья в различных животных моделях, а также у людей, но эти ранние исследования были широко трудно повторить, потому что был использован способ утомительно, долго и дорого. В 2002 году и в дальнейшем настроены в 2009 году, Cawthon предложены и продемонстрировали новый, точный, быстрый и простой протокол на основе ПЦР для оценки длины теломеров и дальнейшего изучения его роли в различных аспектах клеточной биологии, старение и болезни ^19.

Выбор правильного метод измерения теломер для исследования имеет важное значение. В настоящее время существуют различные методы, используемые для измерения длины теломеров, каждый со своим собственнымпреимущества и недостатки. Традиционно, длина теломер измеряется с помощью блот-анализе фрагментов терминал ограничения (ПВР), которая включает в себя:. переваривание ДНК ферментами рестрикции, что не режут теломер повторяется для получения TRFs, б. Саузерн-блот этих TRFs делается путем определения средней длины TRF помощью теломер зонд ^{14, 37.} Хотя этот метод очень точно с малым коэффициентом вариации, является непосредственной мерой, и может быть выгодным для измерения длины распределения, TRF анализ является дорогостоящим, трудоемким и требует, по крайней мере, 3 мкг ДНК. Этот метод также нечувствительно к короткие теломеры и определения длины можно смешивать по субтеломерных ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью зонда связи (TTAGGG) н подобные последовательности они содержат ^{15, 42.}

Другой очень точный метод измерения длины теломер Одноместный теломер длина анализа удлинение (STELA), синглэлектронной молекулы на основе ПЦР методом, который требует лишь небольшого количества ДНК. В этом методе праймеры, чтобы признать G-богатые выступ в конце хромосом и связывается с уникальным субтеломерных последовательности на одной хромосомы, который усиливает теломер конкретной хромосоме. В результате усиления затем визуализируется Саузерн-блоттинга. Этот метод имеет то преимущество, что высокой точностью и способен обнаруживать короткие теломеры выброса ^16. К сожалению, поскольку не все хромосомы имеют G-богатые концах и полезной субтеломерных последовательность, длина теломер можно измерить только на конкретных хромосом и эти измерения не могут представлять длина всех теломеры в клетке ^15.

Другой метод, который практикуется является использование пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) зондов для обнаружения длины теломеры. Количественные Florescence в гибридизация (Q-FISH) позволяет визуализировать теломер во время метафазы, где йAining теломер с зондом PNA пропорционально их размер позволяет сравнение между конкретными теломеры хромосом. Хотя этот метод также может быть использован для клеток в интерфазе, вот длину теломер хромосом для разных не могут быть обнаружены, которая вводит ограничения при измерении длины теломеров в стареющих или редко делящиеся клетки ^17. Поток рыбу вместо проточной цитометрии используется и в настоящее время является наиболее чувствительным методом для измерения длины теломеры клеток крови в клинических условиях, но требует высокой квалификации техников ^18.

В настоящее время стандартного метода измерения средней длины теломер в нашей лаборатории использует точность, чувствительность и простота количественной ПЦР в реальном времени. Этот способ стал возможным для измерения длины теломер по разработке новых праймеров, которые избежать синтез димера праймера полученных продуктов, которые иначе были произведены в качествеtandard анализа из-за повторяющегося характера теломер. Для этого теста измерения длины теломер представлена ​​T / S коэффициент, теломер числа копий повтора к одной копии гена числом. Так как существует прямая пропорциональная зависимость между длиной теломер и количество меченых праймеров теломер связывания с ДНК во время начальной стадии ПЦР, T / S соотношение прямо пропорционально длине теломеров. T / S коэффициент измеряется путем сравнения разности Ct, дробное число циклов, при которой образец накопленных цветение пересекает порог, который несколько стандартных отклонений выше базового цветения, между образцами с теломер праймеры и праймеры SCG ^19. Этот метод был подвергнут критике за ее косвенного измерения длины теломер, которые могут привести к неточным измерениям, например, в случае хромосомных дублирования или вариации числа копий ^15. Кроме того, сравнение исследований часто диfficult, но стандартные олигомеров и созданы для измерения абсолютного длину теломер ^20. Этот метод способствовал повышена за счет Cawthon, используя монохромный анализа кПЦР мультиплекса. В этом анализе ПЦР проводили при более низких температурах в течение первых нескольких циклов, чтобы избежать праймер-димеров связывания и теломер и контрольного гена были проанализированы в той же пробирке ПЦР дальнейшей избежать ошибки. Полученный в результате измерения длины теломер коррелирует с длиной теломер измеряется Саузерн-блоттинга из ПВР и имели более высокую точность ^{15, 19, 36.} На данный момент Qrt-PCR является единственным удобным способом для тестирования больших размеров образца и требует лишь небольшого количества ДНК осуществить. Важной частью этого метода заключается в комплексных мер по борьбе качества, так что, когда это сделано должным образом, этот метод может дать ценную информацию о сравнительных длину теломер. Кроме того, этот метод был адаптирован для использования вне лейкоцитов для измерениядлина теломер в различных тканях ^42.

Кроме того, в целях более глубокого понимания биологии за длину теломер и взаимодействия между двумя противоположными эффектами (то есть укорочение теломер во время репликации и удлинения фермент теломераза), мы сопровождали длины теломер методом с дополнительным анализом, который измеряет активность теломеразы.

Для этой цели мы использовали протокол амплификации теломерных Повтор, Анализ in vitro. Вкратце, лизируют сохранена, ферментативно активной клетки синтезировали теломерных повторов на подложку с использованием олигонуклеотидных теломеразы, и продукты были амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии SYBR Green. Затем результаты были проанализированы путем сравнения образцов и контрольных значений Ct порога. Так как теломераза теплочувствительную фермента, дополнительные термообработке управления запуске рядом друг с образцом ^21.

При измерении длины теломеров может предоставить ценную информацию о возможной роли длину теломер в патофизиологии старения и болезней, длина теломер не статическое свойство и больше информации, необходимой для понимания функции теломер. Исследования Активность теломеразы может добавить информацию о механизмах регулирования теломер длины. Например, управления активацией теломеразы может поддерживать длину теломер и клеточную пролиферацию, но неконтролируемой активации теломеразы может привести к раку. Эти два недорогих и прямой методы в сочетании предоставили нам не только к более убедительные доказательства взаимосвязи между длиной теломер и клеточной стабильности, но и более глубокое представление о возможных механизмах укорочение теломер и восстановления. С помощью этих методов мы надеемся и далее выяснить реакцию клетки к старению и различные состояния клеточной пролиферации с конечной целью лучшего понимания центральной mechanisMS клеточной биологии.

протокол

1. Протокол теломер Длина ¹⁹

1. Выделение ДНК

Большинство методов выделения ДНК может быть использован. Наша лаборатория предпочитает Qiagen DNeasy Kit (# 69506) для крови источников. В зависимости от источника ДНК, например, буккального или других источников, другой способ изоляции может быть использован.

2. Грунтовка:

Все праймеры разбавляли до исходной концентрации 100pmoles/μl в ПЦР класса воде и хранили при -20 ° С до использования. Рабочие запасы праймеры приготовлены и хранят при 20 ° C в течение короткого периода времени (несколько месяцев). Стандартный праймеры использовали для теломеры и β-глобин, SCG, как описано в О'Каллаган соавт. ²⁰ .

Последовательности праймеров:
Тело 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '

Тело 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '

Примечание: Праймеры разбавляют до рабочей концентрации 10pmoles/μl, перед добавлением в реакционную смесь.

3. Серийные разведения геномной ДНК:

Серийные разведения геномной ДНК для Telo и односпальная копий гена (SCG) создаются для создания стандартного значения Ct кривой для анализа. Геномной ДНК использовали экстрагируют из лимфоцитов крови. Эти разведения создаются путем разбавления ДНК методом ПЦР класс H ₂ 0 до каждой концентрации на коэффициент 1,68, получая два набора серийных разведений с использованием тех же геномной ДНК. Исходным концентрации были оптимизированы на основе проб и ошибок и, возможно, должны быть скорректированы при использовании различных реактивы, инструменты, ДНК других видов, типов клеток, и SCG использовали.

Примечание: Серийный разбавления с использованием геномной ДНК делают, смешивая и терпеливо ждала по крайней мере 15 минут до одного часа Befoповторно принимает ДНК для следующего разведения. Каждое разведение требуется время для геномной ДНК для диссоциации. Для длительного хранения, аликвотой серийные разведения в ПЦР-полоски для хранения при температуре -80 ° C. Каждая полоска ПЦР размораживают и используют один раз, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, которые могут повредить ДНК.

4. Реакция установки для RT-PCR

Инструмент, используемый: Roche480 Свет Cycler

Реагент: Roche Свет циклере SYBR-зеленый

Развести тестовых образцов ДНК с конечной концентрацией 10 нг / мкл. Мы тестируем концентрации с использованием Nanodrop или кубита. Мы также разбавить ДНК из 10ng/μl до конечного 5ng/μl. Мы не испытываем концентрации снова.

Компоненты реакции:

ООИ	1x		SCG	1x
H 2 0	6 мкл		H20	6 мкл
Тело 1	0,2 мкл		SCG 1	0,6 мкл
Тело 2	1,8 мкл		SCG 2	1,4 мкл
Rxn смеси	10 мкл		Rxn смеси	10 мкл
ДНК или серийного разведения	2 мкл		ДНК или серийного разведения	2 мкл

Примечание: Master Mix производится без ДНК и с избытком 5% до 10%.

Оба Тэло и SCG совместно выполняемых на той же пластинке с помощью следующей программы. Для проверки на точность, по крайней мере, трех повторов каждого образца и контроля должны быть запущены. Вариации в праймеры могут повлиять на результаты. Наш протокол был оптимизирован для работы на следующий Roche480 Свет Cycler и наши праймеров.

Вitial денатурации
10 мин денатурации 95 ° C
Езда на велосипеде
95 ° C 10 сек удержание
60 ° C 5 секунд удержания
72 ° С 11 сек удержание и одно приобретение
Повторить 45 до 55 раз, сколько требуется

2. Количественное обнаружение теломеразы (QTD) Протокол (на основе QTD Kit союзными Biotech, Inc Кат. Номер MT3012)

Извлечение подготовка

1. Гранул клетки или ткани.
2. Мыть один раз с 1x PBS.
3. Repellet и удалить 1x PBS. *
4. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл 1 × буфера для лизиса на каждые 10 ⁵ -10 ⁶ клеток или 40-100 мг ткани.
5. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
6. Спин вниз образца при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
7. Передача 160 мкл супернатанта в новую пробирку и определяют концентрацию белка.
8. Алиготе и быстро заморозить оставшиеся экстракта на сухой лед / этанол, хранят при температуре -80 ° С.

* В т.его состояние, теломераза в замороженных клетках или тканях остается стабильным в течение по крайней мере года. Когда оттаивали в течение использования, ресуспендирования клеток непосредственно в один буфер для лизиса х.

2.1. Проверять контроли

Регулирование теплового инактивации: Для каждого образца термической обработки дополнительно экстракт контроль путем инкубации при 85 ° С в течение 10 мин до теломеразной активности анализа.

Стандартная кривая для шаблона управления TSR: выполнить количественный ПЦР в реальном времени использования разведения TSR, олигонуклеотида с аналогичной последовательности праймеров теломер входит в комплект для создания стандартной кривой.

1. Подготовьте 1:05 серийных разведений концентрации TSR акций (0,5 amoles / мкл) с лизирующего буфера
2. Выполните стандартное обнаружение теломеразы анализе с использованием 1 мкл каждого разбавления TSR, в том числе фондового концентрации. Эти разведения можно хранить при температуре 4 ° С в течение не менее 2 недель.

2.2. Анализ активности теломеразыQTD использованием ПЦР в реальном времени

1. Для каждого образца, добавьте следующие строки в ПЦР-пробирку или тонкостенных ПЦР планшет (общий объем 25,0 мкл):
   • 12,5 мкл 2 х QTD Премикс
   • 1,0 мкл клеток или тканей экстракт
   • 11,5 мкл ПЦР Квалифицированные воды
2. Тщательно перемешать
3. Программа Real-Time PCR Detection Systems по следующей программе:
   - 25 ° С в течение 20 мин (теломеразы реакции)
   - 95 ° С в течение 10 мин (ПЦР начальный этап активации)
   35-40 циклов:
   - 95 ° С в течение 30 секунд (денатурация)
   - 60 ° C в течение 30 сек (отжиг)
   - 72 ° C в течение 30 сек (расширение)
4. Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер и запустить программу Велоспорт.
5. Сбор порогового цикла или С _Т значение после финиша циклов. Пороговый цикл является циклом, при котором статистически значимое увеличение ΔRn первом обнаружении.

2.3. Анализ данных

1. GeneratEA стандартную кривую с использованием C _T чтений и сравнить активность теломеразы.

Результаты

Пример длину теломер QRT-PCR анализа показан на рисунке 1. В левой верхней части панели, образцы помечены красным и зеленым представлять расположение предметов протестированы на 96-луночный планшет. В правом верхнем углу панели, кривой усиления демонстрируется. Каждый предмет про...

Обсуждение

Длина теломер предоставляет уникальный клеточный маркер для изучения напряженно и старения клеток и предлагает взглянуть на механизмы старения. Так как его роль в старении впервые было предложено, множество исследований было сделано, касающиеся длины теломеров с возрастом, долголет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516