Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة على التكيف السهل بسهولة في المختبر نموذج للتحقيق الاستقطاب البلاعم. في حضور GM-CSF/M-CSF، يتم توجيه الخلايا الجذعية المكونة للدم / السلف من نخاع العظام إلى التمايز الوحيدات، تليها التحفيز M1 أو M2. يمكن تتبع حالة التنشيط من خلال التغييرات في مستضدات سطح الخلية، التعبير الجيني ومسارات إشارات الخلية.

Abstract

توضح هذه المقالة على التكيف بسهولة سهلة في نموذج المختبر للتحقيق الاستقطاب البلاعم. في حضور GM-CSF/M-CSF، يتم توجيه الخلايا الجذعية المكونة للدم / السلف من نخاع العظام إلى التمايز الوحيدات، تليها التحفيز M1 أو M2. يمكن تتبع حالة التنشيط من خلال التغييرات في مستضدات سطح الخلية، التعبير الجيني ومسارات إشارات الخلية.

Introduction

متميزة من الاستجابات الالتهابية الكلاسيكية، الضامة التي تتسلل الأنسجة كثيرا ما عرض حالة التنشيط الاستقطاب التي تلعب دورا حاسما في تنظيم الوظائف الفسيولوجية الأنسجة المضيفة 1-8. على التحفيز، يمكن فرز تنشيط البلاعم إلى الكلاسيكية (M1) والبديلة (M2) التنشيط 2، 4، 9. M1 تنشيط البلاعم يعتمد على تول مثل مستقبلات (TLRs) وتفعيل العامل النووي كابا B (NFκB) / ج يونيو N-محطة كيناز 1 (JNK1)، مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات الالتهابية، مثل TNF-α و IL- 1β وتفعيل iNOS أن يؤدي إلى زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية مثل أكسيد نيتريد (NO) 10، 11. في المقابل، M2 بلعم المجندين تفعيل PPARγ، PPARδ، أو IL-4-STAT6 مسارات، مما يؤدي إلى بديل، المضادة للالتهابات (M2) التنشيط مقترن upregulation من مستقبلات المانوز CD206، وأرجيناز 1 (ARG1) 6، 12 - 14 </ سوب>.

نخاع العظام المستمدة الضامة (BMDM) تقديم نموذج مثالي في المختبر لفهم آليات السيطرة على الاستقطاب من الضامة المنشط 15. على وجه التحديد، وتفعيل الضامة M1 يمكن أن يتسبب بواسطة lipopolysaccharides (LPS) التحفيز، في حين الاستقطاب الضامة M2 يمكن أن يتسبب بواسطة IL-4 و / أو IL-13. ويمكن تحديد الناضجة نخاع العظام المستمدة الضامة والضامة تفعيلها من خلال تحليل التدفق الخلوي للتعبير عن المستضدات السطحية، بما في ذلك CD11b، F4/80، CD11c و، CD206، CD69، CD80 CD86 و 9 و 16 و 17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس التغيرات في إنتاج السيتوكينات ومسارات إشارات الخلية المرتبطة الاستقطاب البلاعم التي كتبها الكمي RT-PCR والغربية النشاف، على التوالي. وباختصار، يمكن الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة نموذجا ذات الصلة لدراسة الاستقطاب البلاعم في المختبر.

Protocol

1. عزل خلايا نخاع العظام

  1. عزل عظم الفخذ وعظام الساق 6-8 الفئران منذ أسبوع، وشطف الشعر ثم قطع مفتوحة العظام.
  2. استخدام إبرة 21G و 10 مل حقنة لطرد نخاع في برنامج تلفزيوني الباردة +2٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) (3-5 مل / الماوس).
  3. تمرير نخاع من خلال إبرة 21G 4-6 مرات لفصل الخلايا.
  4. تمر الخلايا من خلال 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لإزالة كتل الخلايا والعظام والشعر والخلايا / الأنسجة الأخرى.
  5. إضافة 3 حجم NH 4 حل الكلورين (0.8٪ NH 4 الكلورين حل، Stemcell التكنولوجيا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  6. تدور باستمرار خلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. Resuspend وبيليه الخلية في برنامج تلفزيوني الباردة +2٪ FBS (20-50 مل، اعتمادا على كمية من الخلايا).

2. الاستقراء تشكيل BMDM

  1. Resuspend معزولة خلايا نخاع العظام في BMDM متوسطة النمو (الخلايا 2x10 6 / مل).

BMDM النمو المتوسطة:

متوسط ​​Iscove في التعديل Dulbecco ل(IMDM) + 10٪ FBS + 15٪ تصفيتها (0.2 ميكرومتر) L-929 خلية (ATCC، CCL-1) ثقافة طاف (التي تحتوي على عامل تحفيز الوحيدات مستعمرة، M-CSF) أو 10 نانوغرام / مل M -CSF.

ملاحظة: L-929 طاف الخلية تحتوي M-CSF 18. لضمان النشاط الفعال المتوسطة مكيفة، 5 × 5 10 L-929 هي المصنفة الخلايا في T75 سم 2 قوارير لأيام 6-7، يتم جمع المتوسطة الهواء وتمريرها من خلال مرشح 0.45 ميكرون قبل الاستخدام. مأخوذة المتوسطة يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 1-2 أشهر.

  1. خلايا البذور في 6 أو 12 جيدا لوحات زراعة الأنسجة (اعتمادا على التصميم التجريبي) (كورنينج COSTAR).
  2. تغيير الطازجة المتوسطة النمو BMDM في اليوم 3.
  3. في يوم 7، يتم تقييم تشكيل BMDM ناضجة باستخدام تحليل التدفق الخلويوfluorophore الأجسام المضادة مترافق للكشف عن الخلايا معربا عن CD11b وF4/80.

3. BMDM تنشيط الاستقطاب

  1. في يوم 7، تغيير إلى متوسطة التحفيز الطازجة: لتفعيل M1، استخدم IMDM التي تحتوي على FBS 10٪ و 100 نانوغرام / مل LPS أو 100 نانوغرام / مل LPS مع 50 نانوغرام / مل IFNγ؛ لتفعيل M2، استخدم IMDM تحتوي على 10٪ FBS مع 10 نانوغرام / مل IL-4 و / أو 10 نانوغرام / مل IL-13.
  2. جمع BMDMs يحفزه فصل لهم من الطبق باستخدام دافئة 0.05٪ التربسين، تليها غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني يحتوي على FBS 10٪.

ملاحظة: لفصل و resuspend الضامة ناضجة بعد التمايز، 0.05٪ حل التربسين (التي تحتوي على 0.48 ملي EDTA، إينفيتروجن) أو 2-5 ملي EDTA في الكالسيوم والمغنيسيوم وخالية من برنامج تلفزيوني أو عازلة متوازن هانك (HBSS) يمكن استخدامها. عند استخدام الجهاز الهضمي المتوسطة التي تحتوي على التربسين، يتم التعامل مع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أقل من 10 دقيقة لتجنب فقدان سوروجه البروتينات بسبب الإفراط في الهضم.

  1. استخدام الأجسام المضادة للكشف عن التعبير عن مستضدات سطح الخلية، بما في ذلك CD11b، F4/80، CD11c و، CD206، CD69، CD80 CD86 أو عند نقاط زمنية مختلفة باستخدام الإجراءات تلطيخ التدفق الخلوي القياسية.
  2. تحديد التعبير عن الجينات المميزة من الضامة M1 و M2 المنشط بما في ذلك IL-1β، TNF-α و IL-6 (تفعيل M1) أو IL-10، IL-13، arginase1 وPPARγ (تفعيل M2) باستخدام QRT-PCR. تحديد تفعيل مسارات إشارات الخلية المشاركة في تفعيل الضامة M1 أو M2 من خلال تحليل النشاف الغربية.

النتائج

ويرد وصف تخطيطي لإجراء الجيل BMDM (الشكل 1). ويمكن ملاحظة نقاء عالية من الضامة ناضجة في يوم 7 عندما تمثل 95-99٪ من CD11b + F4/80 + الخلايا (الشكل 2). يمكن فحص الضامة الاستقطاب باستخدام الأجسام المضادة ضد CD11b، F4/80، وCD11c وCD206 تليها تحليل التدفق الخلوي. كما هو مبين في

Discussion

نفيدكم هنا إجراء بسيط وقابلة للتكيف بسهولة في المختبر للحث على تفعيل الضامة المستمدة من الخلايا الاصلية نخاع العظام. هذا الإجراء يمكن أن تستخدم للتحقيق في الآليات المسؤولة عن استقطاب الضامة. نقاء الضامة ناضجة تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول المتوسطات 9...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (BGIA 7850037 للدكتور Beiyan تشو).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech 315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved