Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Resumo

O artigo descreve a adaptação prontamente fácil In vitro Modelo para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Resumo

O artigo descreve um prontamente adaptável fácil modelo in vitro para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Introdução

Distinta de respostas inflamatórias clássicos, macrófagos que infiltram os tecidos muitas vezes exibir o status de ativação polarizada que desempenha um papel crucial na regulação das funções fisiológicas do tecido hospedeiro ^1-8. Após a estimulação, a ativação dos macrófagos podem ser classificados em clássico (M1) e alternativos (M2) a ativação ^{2, 4, 9.} M1 activação macrófago depende receptores do tipo Toll (TLR) e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1), levando à produção de citoquinas inflamatórias, tais como TNF-e IL-α 1β e activação da iNOS, que resulta num aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, como o óxido de nitreto de (NO), ^{10, 11.} Em contraste, os macrófagos M2 recrutas activação de PPARy, PPARô, ou IL-4-STAT6 caminhos, conduzindo a, anti-inflamatórios activação alternativa (M2), que está associado com a sobre-regulação do receptor de manose de CD206, e arginase 1 (Arg1) ^{6, 12 - 14 <}/ Sup>.

Macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) apresentam um ideal modelo in vitro para entender os mecanismos que controlam a polarização de macrófagos ativados ^15. Especificamente, a activação de macrófagos M1 pode ser induzida por lipopolissacáridos (LPS) de estimulação, enquanto M2 polarização de macrófagos pode ser induzida por IL-4 e / ou IL-13. Osso maduro macrófagos derivados da medula e macrófagos activados podem ser identificados através de análise de citometria de fluxo para a expressão de antigénios de superfície, incluindo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 ^{9, 16, 17.} Além disso, as alterações na produção de citoquinas e as vias de sinalização celulares associados com a polarização de macrófagos pode ser medida por RT-PCR quantitativo e Western blotting, respectivamente. Em resumo, rato macrófagos derivados de medula óssea pode servir como um modelo relevante para estudar a polarização de macrófagos in vitro.

Protocolo

1. Isolamento de Células de Medula Óssea

1. Isolar fêmur e dos ossos da tíbia 6-8 semanas de idade, enxaguar o cabelo e, em seguida, cortado o osso.
2. Use uma agulha de 21G e seringa de 10 ml para expulsar medula em frio PBS 2% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS) (3-5 ml / mouse).
3. Passa medula através de uma agulha 21G 4-6 vezes para dissociar as células.
4. Passa células através de um coador de 70 mM para remover aglomerados de células, células ósseas, cabelo e outras células / tecidos.
5. Adicionar 3 volumes de solução _de NH4CI (solução de NH ₄ Cl, Stemcell Tecnologia 0,8%), e incubar em gelo durante 10 min para remover os glóbulos vermelhos.
6. Girar as células a 500 xg por 5 min a 4 ° C.
7. Ressuspender o sedimento celular em PBS frio 2% de FBS (20-50 ml, dependendo da quantidade de células).

2. Indução Formação BMDM

1. Ressuspender as células de medula óssea isoladas em meio de crescimento BMDM (2x10 ⁶ células / ml).

BMDM meio de crescimento:

Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) + FBS a 10% + 15% de filtrado (0,2 um), L-929 de células (ATCC, CCL-1), sobrenadante de cultura (contendo monócitos factor estimulador de colónias, o M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF.

Nota: L-929 contém sobrenadante celular M-CSF ^18. Para assegurar a actividade eficaz do meio condicionado, 5 x 10 ⁵ células L-929 foram semeadas em ² frascos T75 cm por 6-7 dias, o meio condicionado é recolhido e passado através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. Aliquotas de meio pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C durante 1-2 meses.

2. Células de sementes em placas de 6 ou 12 poços (de cultura de tecidos, dependendo do desenho experimental) (Corning Costar).
3. Alterar meio de crescimento BMDM fresco no dia 3.
4. No dia 7, a formação de BMDM madura é avaliada utilizando análise de citometria de fluxoe anticorpos conjugados com fluoróforo para detectar células que expressam CD11b e F4/80.

3. BMDM Ativação Polarizada

1. No dia 7, mudar para meio de estimulação fresco: para a activação M1, utilizar IMDM contendo FBS a 10% e 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS de 50 ng / mL de IFN-y, para a activação M2, utilizar IMDM contendo 10% de FBS com 10 ng / ml de IL-4 e / ou 10 ng / ml de IL-13.
2. Recolhe BMDMs estimuladas por separá-las a partir do prato quente usando tripsina a 0,05%, seguido por lavagem das células duas vezes com PBS contendo 10% de FBS.

Nota: Para separar e voltar a suspender os macrófagos maduros, após diferenciação, solução de tripsina a 0,05% (contendo EDTA 0,48 mM, Invitrogen) ou 2-5 mM em EDTA-Ca e Mg livre de PBS ou tampão de equilibrada de Hank (HBSS) pode ser usado. Quando utilizando o meio digestivo contendo tripsina, as células são tratadas a 37 ° C durante menos de 10 minutos para evitar a perda de surcara proteínas devido ao excesso de digestão.

3. Utilização de anticorpos para detectar a expressão de antigénios de superfície celular, incluindo a de CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 em diferentes pontos de tempo, utilizando procedimentos de coloração de citometria de fluxo convencionais.
4. Determinar a expressão dos genes característicos de macrófagos M1 e M2 activados incluindo IL-1β, TNF-α e IL-6 (activação M1) ou IL-10, IL-13, arginase1 e PPARy (activação M2) utilizando qRT-PCR. Determinar a activação de vias de sinalização celular envolvidas na ativação dos macrófagos M1 ou M2 por Western blotting.

Resultados

Uma descrição esquemática do procedimento BMDM geração é apresentada (Figura 1). Alta pureza dos macrófagos maduros podem ser observados no dia 7, quando eles representam 95 a 99% das células CD11b + F4/80 + (Figura 2). Macrófagos polarizados podem ser examinados usando anticorpos contra CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguido por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 3, os macrófagos M1 são detectados como F4/80 + CD11b + CD11c-CD206 células ...

Discussão

Descrevemos aqui um processo simples e facilmente adaptável in vitro para induzir a activação dos macrófagos derivados de células progenitoras da medula óssea. Este procedimento pode ser utilizado para a investigação dos mecanismos responsáveis ​​pela polarização dos macrófagos. A pureza dos macrófagos maduros obtidos utilizando este protocolo médias de 95-99%, e não há procedimentos de purificação adicionais são necessários. Para investigar a função de genes específicos de interesse ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
IMDM	Thermo Scientific	SH30259.01
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438-026
Murine GM-CSF	PeproTech	315-03
NH4Cl	StemCell Technologies	7850
L-929	ATCC	CCL-1
70 μm cell strainer	BD Biosciences	352350
10 x PBS	Thermo Scientific	AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC	eBioscience	17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC	eBioscience	11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE	eBioscience	12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE	eBioscience	12-0862-81
Propidium Iodine	Invitrogen	P3566