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Resumo

O artigo descreve a adaptação prontamente fácil In vitro Modelo para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Resumo

O artigo descreve um prontamente adaptável fácil modelo in vitro para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Introdução

Distinta de respostas inflamatórias clássicos, macrófagos que infiltram os tecidos muitas vezes exibir o status de ativação polarizada que desempenha um papel crucial na regulação das funções fisiológicas do tecido hospedeiro 1-8. Após a estimulação, a ativação dos macrófagos podem ser classificados em clássico (M1) e alternativos (M2) a ativação 2, 4, 9. M1 activação macrófago depende receptores do tipo Toll (TLR) e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1), levando à produção de citoquinas inflamatórias, tais como TNF-e IL-α 1β e activação da iNOS, que resulta num aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, como o óxido de nitreto de (NO), 10, 11. Em contraste, os macrófagos M2 recrutas activação de PPARy, PPARô, ou IL-4-STAT6 caminhos, conduzindo a, anti-inflamatórios activação alternativa (M2), que está associado com a sobre-regulação do receptor de manose de CD206, e arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) apresentam um ideal modelo in vitro para entender os mecanismos que controlam a polarização de macrófagos ativados 15. Especificamente, a activação de macrófagos M1 pode ser induzida por lipopolissacáridos (LPS) de estimulação, enquanto M2 polarização de macrófagos pode ser induzida por IL-4 e / ou IL-13. Osso maduro macrófagos derivados da medula e macrófagos activados podem ser identificados através de análise de citometria de fluxo para a expressão de antigénios de superfície, incluindo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Além disso, as alterações na produção de citoquinas e as vias de sinalização celulares associados com a polarização de macrófagos pode ser medida por RT-PCR quantitativo e Western blotting, respectivamente. Em resumo, rato macrófagos derivados de medula óssea pode servir como um modelo relevante para estudar a polarização de macrófagos in vitro.

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Protocolo

1. Isolamento de Células de Medula Óssea

  1. Isolar fêmur e dos ossos da tíbia 6-8 semanas de idade, enxaguar o cabelo e, em seguida, cortado o osso.
  2. Use uma agulha de 21G e seringa de 10 ml para expulsar medula em frio PBS 2% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS) (3-5 ml / mouse).
  3. Passa medula através de uma agulha 21G 4-6 vezes para dissociar as células.
  4. Passa células através de um coador de 70 mM para remover aglomerados de células, células ósseas, cabelo e outras células / tecidos.
  5. Adicionar 3 volumes de solução de NH4CI (solução de NH 4 Cl, Stemcell Tecnologia 0,8%), e incubar em gelo durante 10 min para remover os glóbulos vermelhos.
  6. Girar as células a 500 xg por 5 min a 4 ° C.
  7. Ressuspender o sedimento celular em PBS frio 2% de FBS (20-50 ml, dependendo da quantidade de células).

2. Indução Formação BMDM

  1. Ressuspender as células de medula óssea isoladas em meio de crescimento BMDM (2x10 6 células / ml).

BMDM meio de crescimento:

Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) + FBS a 10% + 15% de filtrado (0,2 um), L-929 de células (ATCC, CCL-1), sobrenadante de cultura (contendo monócitos factor estimulador de colónias, o M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF.

Nota: L-929 contém sobrenadante celular M-CSF 18. Para assegurar a actividade eficaz do meio condicionado, 5 x 10 5 células L-929 foram semeadas em 2 frascos T75 cm por 6-7 dias, o meio condicionado é recolhido e passado através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. Aliquotas de meio pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C durante 1-2 meses.

  1. Células de sementes em placas de 6 ou 12 poços (de cultura de tecidos, dependendo do desenho experimental) (Corning Costar).
  2. Alterar meio de crescimento BMDM fresco no dia 3.
  3. No dia 7, a formação de BMDM madura é avaliada utilizando análise de citometria de fluxoe anticorpos conjugados com fluoróforo para detectar células que expressam CD11b e F4/80.

3. BMDM Ativação Polarizada

  1. No dia 7, mudar para meio de estimulação fresco: para a activação M1, utilizar IMDM contendo FBS a 10% e 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS de 50 ng / mL de IFN-y, para a activação M2, utilizar IMDM contendo 10% de FBS com 10 ng / ml de IL-4 e / ou 10 ng / ml de IL-13.
  2. Recolhe BMDMs estimuladas por separá-las a partir do prato quente usando tripsina a 0,05%, seguido por lavagem das células duas vezes com PBS contendo 10% de FBS.

Nota: Para separar e voltar a suspender os macrófagos maduros, após diferenciação, solução de tripsina a 0,05% (contendo EDTA 0,48 mM, Invitrogen) ou 2-5 mM em EDTA-Ca e Mg livre de PBS ou tampão de equilibrada de Hank (HBSS) pode ser usado. Quando utilizando o meio digestivo contendo tripsina, as células são tratadas a 37 ° C durante menos de 10 minutos para evitar a perda de surcara proteínas devido ao excesso de digestão.

  1. Utilização de anticorpos para detectar a expressão de antigénios de superfície celular, incluindo a de CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 em diferentes pontos de tempo, utilizando procedimentos de coloração de citometria de fluxo convencionais.
  2. Determinar a expressão dos genes característicos de macrófagos M1 e M2 activados incluindo IL-1β, TNF-α e IL-6 (activação M1) ou IL-10, IL-13, arginase1 e PPARy (activação M2) utilizando qRT-PCR. Determinar a activação de vias de sinalização celular envolvidas na ativação dos macrófagos M1 ou M2 por Western blotting.

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Resultados

Uma descrição esquemática do procedimento BMDM geração é apresentada (Figura 1). Alta pureza dos macrófagos maduros podem ser observados no dia 7, quando eles representam 95 a 99% das células CD11b + F4/80 + (Figura 2). Macrófagos polarizados podem ser examinados usando anticorpos contra CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguido por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 3, os macrófagos M1 são detectados como F4/80 + CD11b + CD11c-CD206 células ...

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Discussão

Descrevemos aqui um processo simples e facilmente adaptável in vitro para induzir a activação dos macrófagos derivados de células progenitoras da medula óssea. Este procedimento pode ser utilizado para a investigação dos mecanismos responsáveis ​​pela polarização dos macrófagos. A pureza dos macrófagos maduros obtidos utilizando este protocolo médias de 95-99%, e não há procedimentos de purificação adicionais são necessários. Para investigar a função de genes específicos de interesse ...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (BGIA 7.850.037 para Beiyan Dr. Zhou).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

Referências

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
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  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
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  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
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  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

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