חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

Summary

המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות במבחנה מודל כדי לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.

Abstract

המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות במודל חוץ גופית לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.

Introduction

להבדיל מתגובות דלקתיות הקלסיים, מקרופגים שלחדור רקמות לעתים קרובות להציג את מצב הפעלה של מקוטב שממלא תפקיד מכריע בויסות פונקציות פיסיולוגיות של רקמות מארחות ^1-8. על הגירוי, הפעלת מקרופאג ניתן למיין לקלסית (M1) ואלטרנטיבית (M2) הפעלה ^{2, 4, 9.} הפעלת מקרופאג M1 תלויה בקולטנית Toll-כמו (TLRs) והפעלה של פקטור הגרעיני kappa B (NFκB) / ג ביוני N-מסוף קינאז 1 (JNK1), מוביל לייצור של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNF-α ו-IL- 1β והפעלה של INOS כי תוצאות בייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי כגון תחמוצת ניטריד (NO) ^{10, 11.} בניגוד לכך, מגויסי M2 macrophage הפעלת PPARγ, PPARδ, או IL-4-Stat6 מסלולים, שהובילו להפעלה אלטרנטיבית, אנטי דלקתית (M2), כי הוא קשור עם גברת ביטוי של הקולטן מנוז CD206, ו1 arginase (ARG1) ^{6, 12 - 14 <}/ Sup>.

מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) להציג אידיאליים במודל חוץ גופית להבין את מנגנוני שליטה קיטוב של מקרופאגים הופעל ^15. באופן ספציפי, הפעלה של מקרופאגים M1 יכולה להיגרם על ידי lipopolysaccharides (LPS) גירוי, בעוד שקיטוב של מקרופאגים M2 יכול להיגרם על ידי IL-4 ו / או IL-13. ניתן לזהות מקרופאגים בוגרים מח עצם נגזרות ומקרופגים מופעלים באמצעות ניתוח תזרים cytometry לביטוי של פני שטח אנטיגנים, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ו CD86 ^{9, 16, 17.} בנוסף, ניתן למדוד שינויים בייצור ציטוקינים ומסלולי איתות סלולריים הקשורות לקיטוב מקרופאג על ידי כמותי RT-PCR והמערבי סופג, בהתאמה. לסיכום, מקרופאגים מח עצם נגזרות עכבר יכולים לשמש כמודל רלוונטי ללמוד קיטוב מקרופאג במבחנה.

Protocol

1. בידוד של תאים במח עצם

1. לבודד את עצם ירך ועצמות שוקה 6-8 עכברים ישנים שבוע, לשטוף את השיער ולאחר מכן לחתוך את העצם.
2. שימוש במחט 21G ומזרק 10 מ"ל כדי לשטוף את מוח לסרום קר PBS 2% חום מומת שור עוברי (FBS) (3-5 מ"ל / עכבר).
3. מח עובר דרך מחט 21G 4-6 פעמים לנתק את התאים.
4. תאים עוברים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים, עצמות, שיער ותאים / רקמות אחרות.
5. הוסף 3 נפח של פתרון Cl ₄ NH (0.8% פתרון ₄ Cl NH, StemCell טכנולוגיה), ולדגור על קרח במשך 10 דקות כדי להסיר את תאי דם אדומים.
6. ספין למטה תאים ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. Resuspend התא גלולה ב PBS 2% FBS הקר (20-50 מ"ל, תלוי בכמות תאים).

2. גיבוש BMDM אינדוקציה

1. Resuspend תאי מח העצם המבודדים במדיום גידול BMDM (2x10 ⁶ תאים / מ 'יב).

מדיום גידול BMDM:

בינוני של של Iscove שינוי Dulbecco (IMDM) + 10% FBS + 15% מסוננים (0.2 מיקרומטר) תא (ATCC, CCL-1) התרבות supernatant (המכיל גורם המגרה מונוציטים מושבה, M-CSF) או 10 ng / ml M L-929 -CSF.

הערה: L-929 supernatant התא מכיל M-CSF ^18. כדי להבטיח פעילות האפקטיבית של מדיום אוויר, 5 X 10 ⁵ L-929 תאים הם זורעים בT75 ס"מ ² צלוחיות עבור 6-7 ימים, בינונית מותנה נאסף ועבר דרך 0.45 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. ניתן להשתמש בו באופן מיידי aliquots בינוני או מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך 1-2 חודשים.

2. תאי זרע ב6 או 12 צלחות תרבית רקמה כן (תלוי בעיצוב ניסיוני) (קורנינג שחקן משנה).
3. שינוי מדיום גידול BMDM טרי ביום 3.
4. ביום 7, היווצרות BMDM הבוגרת מוערכת באמצעות ניתוח תזרים cytometryוfluorophore נוגדנים מצומדות כדי לזהות תאי המבטאים CD11b וF4/80.

3. הפעלה מקוטבת BMDM

1. ביום 7, לשנות לגירוי בינוני טרי: להפעלת M1, השתמש IMDM המכיל 10% FBS ו100 LPS ng / ml או 100 ng / ml LPS עם 50 ng / ml IFNγ; להפעלת M2, השתמש IMDM המכיל 10% FBS עם 10 ng / ml IL-4 ו / או 10 ng / ml IL-13.
2. לאסוף BMDMs מגורה על ידי ניתוקם מהצלחת באמצעות 0.05% טריפסין חם, ואחריו על ידי שטיפה את התאים פעמיים עם PBS המכיל 10% FBS.

הערה: כדי לנתק וresuspend מקרופאגים הבשלים לאחר התמיינות, פתרון טריפסין 0.05% (המכיל 0.48 מ"מ EDTA, Invitrogen) או 2-5 מ"מ EDTA בCa-Mg וללא חיץ PBS או מאוזן של האנק (HBSS) יכולה להיות בשימוש. בעת שימוש במדיום עיכול המכיל טריפסין, טיפול בתאים על 37 מעלות צלזיוס במשך פחות מ -10 דקות כדי למנוע אובדן של סורפני חלבונים בשל יתר מערכת העיכול.

3. השתמש בנוגדנים כדי לזהות ביטוי של פני שטח אנטיגנים תא, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 או CD86 בנקודות זמן שונים תוך שימוש בנהלים מכתים cytometry זרימה רגילות.
4. קביעת ביטוי של גנים אופייניים למקרופאגים M1 ו-M2 הופעל כולל IL-1β, TNF-α ו-IL-6 (הפעלת M1) או IL-10, IL-13, וarginase1 PPARγ (הפעלת M2) באמצעות qRT-PCR. לקבוע הפעלה של מסלולי איתות תא המעורבים בהפעלה של מקרופאגים M1 או M2 על ידי ניתוח סופג מערבי.

תוצאות

תיאור סכמטי של הליך דור BMDM מוצג (איור 1). טוהר גבוה של מקרופאגים בוגרים ניתן להבחין ביום 7, כאשר הם מייצגים 95-99% מCD11b + F4/80 + תאים (איור 2). ניתן לבחון מקרופאגים מקוטבות באמצעות נוגדנים נגד CD11b, F4/80, CD11c וCD206 ואחרי ניתוח cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 3,<...

Discussion

אנו מדווחים כאן הליך פשוט וישימה בקלות במבחנה כדי לגרום להפעלה של מקרופאגים הנגזרים מתאי אב במח עצם. הליך זה יכול לשמש לחקירה של מנגנונים אחראים לקיטוב של מקרופאגים. טוהר מקרופאגים בוגרים הושג באמצעות ממוצעי פרוטוקול זה 95-99%, ואין הליכי טיהור נוספים נדרשים. כדי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
IMDM	Thermo Scientific	SH30259.01
Fetal bovine serum	Invitrogen	10438-026
Murine GM-CSF	PeproTech	315-03
NH4Cl	StemCell Technologies	7850
L-929	ATCC	CCL-1
70 μm cell strainer	BD Biosciences	352350
10 x PBS	Thermo Scientific	AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC	eBioscience	17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC	eBioscience	11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE	eBioscience	12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE	eBioscience	12-0862-81
Propidium Iodine	Invitrogen	P3566