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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach adaptive In vitro Modell Makrophagen Polarisation zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt eine einfache adaptive leicht in vitro Modell zur Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Einleitung

Im Unterschied zu klassischen Entzündungsreaktionen, Makrophagen, die Gewebe infiltrieren zeigen oft polarisiert Aktivierungsstatus, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung Wirtsgewebe physiologischen Funktionen 1-8 spielt. Nach Stimulation kann Makrophagenaktivierung in classic (M1) und alternativen (M2) Aktivierung 2, 4, 9 sortiert werden. M1 Makrophagenaktivierung hängt von Toll-like Rezeptoren (TLR) und Aktivierung von nuclear factor kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), was zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL- 1β und Aktivierung von iNOS, die zu einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies wie Nitrid-Oxid (NO) 10, 11. Im Gegensatz dazu führt M2 Makrophagen-Aktivierung rekrutiert PPAR, PPAR oder IL-4-STAT6 Wege, um alternative, entzündungshemmende (M2), die mit Aktivierung Hochregulation von Mannose-Rezeptor CD206 zugeordnet ist, und Arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDM) präsentieren eine ideale in vitro Modell, um die Mechanismen, die die Polarisation des aktivierten Makrophagen 15 zu verstehen. Insbesondere kann die Aktivierung von Makrophagen M1 durch Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation induziert werden, während Polarisation M2 Makrophagen IL-4 und / oder IL-13 induziert werden kann. Ältere Knochenmark stammende Makrophagen und aktivierten Makrophagen durch Durchflusszytometrie-Analyse auf die Expression von Oberflächen-Antigenen, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 und CD86 9, 16, 17 identifiziert werden. Darüber hinaus können Änderungen in der Produktion von Zytokinen und Zellsignalwege mit Makrophagen Polarisationsrichtung zugeordnet ist, durch quantitative RT-PCR und Western Blot, jeweils gemessen werden. Zusammenfassend kann Knochenmark der Maus Makrophagen als relevantes Modell Makrophagen Polarisation in-vitro-Studie dienen.

Protokoll

1. Isolation von Knochenmarkzellen

  1. Isolieren Oberschenkels und des Schienbeins Knochen von 6-8 Wochen alten Mäusen, abspülen Haar und dann aufgeschnitten den Knochen.
  2. Verwenden Sie eine Nadel 21G und 10-ml-Spritze zu spülen Knochenmark in kaltem PBS +2% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS) (3-5 ml / Maus).
  3. Pass Knochenmark durch eine 21G Nadel 4-6 mal um die Zellen zu distanzieren.
  4. Pass Zellen durch eine 70 um Zellsieb zu Zellklumpen, Knochen, Haare und andere Zellen / Gewebe zu entfernen.
  5. In 3 Volumen von NH 4 Cl-Lösung (0,8% NH 4 Cl-Lösung, Stemcell Technology), und Inkubation auf Eis für 10 min, um rote Blutkörperchen zu entfernen.
  6. Spin down Zellen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C.
  7. Zellpellet in kaltem PBS + 2% FBS (20-50 ml, je nach der Menge der Zellen).

2. Induction BMDM Formation

  1. Resuspendieren der isolierten Knochenmarkzellen in BMDM Wachstumsmedium (2x10 6 Zellen / ml).

BMDM Wachstumsmedium:

Iscoves Modified Dulbecco-Medium (IMDM) + 10% FBS + 15% gefiltert (0,2 um) L-929-Zellen (ATCC, CCL-1) Kulturüberstand (mit Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF) oder 10 ng / ml M -CSF.

Hinweis: L-929 Zellüberstand enthält M-CSF 18. Um die effektive Aktivität des konditionierten Mediums, 5 X 10 5 sicherzustellen L-929-Zellen in T75 cm 2-Kolben für 6-7 Tage ausgesät, konditionierte Medium gesammelt und durch ein 0,45 um-Filter vor dem Gebrauch übergeben. Aliquots Medium kann sofort verwendet werden oder gespeichert in -80 ° C für 1-2 Monate.

  1. Seed-Zellen in 6 oder 12 Loch-Gewebekulturplatten (je nach Versuchsaufbau) (Corning Costar).
  2. Ändern frisch BMDM Wachstumsmedium am 3. Tag.
  3. Am 7. Tag wird die Bildung von reifen BMDM ausgewertet mittels Durchflusszytometrie-Analyseund Fluorophor konjugierten Antikörpern zu erkennen exprimieren CD11b und F4/80.

3. BMDM Polarized Aktivierung

  1. Am Tag 7, an die frische Stimulation Medium ändern: für M1 Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS und 100 ng / ml LPS oder 100 ng / ml LPS mit 50 ng / ml IFN; M2 für Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS mit 10 ng / ml IL-4 und / oder 10 ng / ml IL-13.
  2. Sammeln angeregt BMDMs durch Lösen sie aus der Schale mit warmem 0,05% Trypsin, gefolgt vom Waschen der Zellen zweimal mit PBS, enthaltend 10% FBS.

Hinweis: Um lösen und suspendieren reifen Makrophagen nach der Differenzierung, 0,05% Trypsin-Lösung (enthaltend 0,48 mM EDTA, Invitrogen) oder 2-5 mM EDTA in Ca-und Mg-freiem PBS oder Hanks-Puffer (HBSS) verwendet werden. Bei der Verwendung von Trypsin Verdauung Medium werden die Zellen bei 37 ° C für weniger als 10 Minuten behandelt, um Verlust zu vermeiden surGesicht Proteine ​​aufgrund über-Verdauung.

  1. Mit Antikörpern, um die Expression von Zelloberflächen-Antigene, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 oder CD86 zu verschiedenen Zeitpunkten mit Standard Durchflusszytometrie Färbeverfahren.
  2. Bestimmen Expression von Genen charakteristisch aktivierten M1 und M2 Makrophagen einschließlich IL-1β, TNF-α und IL-6 (M1 Aktivierung) oder IL-10, IL-13, arginase1 und PPAR (M2 Aktivierung) mit qRT-PCR. Bestimmen Aktivierung der Zelle Signalwege in der Aktivierung von M1 oder M2 Makrophagen durch Western-Blot-Analyse beteiligt.

Ergebnisse

Eine schematische Beschreibung des BMDM Generation Verfahren vorgestellt (Abbildung 1). Hohe Reinheit von reifen Makrophagen an Tag 7 beobachtet werden, wenn sie 95 bis 99% der CD11b + F4/80 + Zellen (Abbildung 2) zu vertreten. Polarisierte Makrophagen untersucht werden unter Verwendung von Antikörpern gegen CD11b, F4/80, gefolgt CD11c und CD206 mittels Durchflusszytometrie-Analyse. Wie in Abbildung 3 gezeigt, sind M1 Makrophagen erkannt CD11b + CD11c + + F4/80 CD206-Z...

Diskussion

Wir berichten hier über eine einfache und leicht anpassbar in vitro Verfahren zur Aktivierung von Makrophagen aus Knochenmark-Vorläuferzellen abgeleitet induzieren. Dieses Verfahren kann zur Untersuchung der Mechanismen, die für die Polarisation von Makrophagen verwendet werden. Die Reinheit von reifen Makrophagen unter Verwendung dieses Protokolls beträgt 95 bis 99%, und keine zusätzlichen Reinigungsschritte benötigt werden. Um die Funktion bestimmter Gene von Interessen im Rahmen der Makrophagen-Polaris...

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (BGIA 7850037 Dr. Beiyan Zhou) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech 315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

Referenzen

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  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
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