АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В статье описана легко легко адаптивная В пробирке Модель для изучения поляризации макрофагов. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Аннотация

В статье описана легко легко адаптивная в пробирке модель для исследования макрофагов поляризации. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Введение

Отличной от классической воспалительной реакции, макрофаги, которые пропитывают ткани часто демонстрируют поляризованного состояния активации, который играет важную роль в регуляции тканей хозяина физиологические функции 1-8. При стимуляции, активации макрофагов можно разделить на классические (M1) и альтернативные (М2) активация 2, 4, 9. M1 активации макрофагов зависит от Toll-подобных рецепторов (TLR,) и активацию ядерного фактора каппа В (NFκB) / с-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1), что приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL- 1β и активации иСОА, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода, таких как нитрид азота (NO) 10, 11. В противоположность этому, M2 активации макрофагов новобранцев PPAR-, PPAR, или IL-4 STAT6 путей, что приводит к альтернативе, противовоспалительные (М2) активации, которая связана с активацией рецептора маннозы CD206 и аргиназа 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Вир>.

Костного мозга макрофагов (BMDM) представляют идеал в пробирке модель, чтобы понять механизмы, контролирующие поляризации активированными макрофагами 15. В частности, активация М1 макрофагов может быть индуцирована липополисахаридов (ЛПС) стимуляции, тогда поляризации M2 макрофагов может быть индуцирована IL-4 и / или IL-13. Зрелые костного мозга макрофаги и активированные макрофаги могут быть идентифицированы посредством анализа потока цитометрии экспрессии поверхностных антигенов, в том числе CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 и CD86, 9, 16, 17. Кроме того, изменения в продукции цитокинов и клеточных сигнальных путей, связанных с макрофагами поляризации можно измерить с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, соответственно. Таким образом, мыши костного мозга макрофаги могут служить соответствующие модели для изучения макрофаг поляризации в пробирке.

протокол

1. Выделение клеток костного мозга

  1. Изолировать бедра и голени кости от 6-8 недельных мышей, ополоснуть волосы, а затем разрезать кости.
  2. Используйте 21G иглу и шприц объемом 10 мл, чтобы избавиться от мозга в холодной PBS +2% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (3-5 мл / мышь).
  3. Передайте мозга через 21G иглу 4-6 раз для диссоциации клеток.
  4. Проход клеток через 70 мкм сито ячейка для удаления скопления клеток, костей, волос и других клеток / ткани.
  5. Добавить 3 объема раствора NH4Cl (0,8% раствора NH4Cl, Stemcell технологии), и инкубировать на льду в течение 10 мин для удаления красных кровяных телец.
  6. Спином вниз клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
  7. Ресуспендируют осадок клеток в холодном PBS + 2% FBS (20-50 мл, в зависимости от количества клеток).

2. Формирование Индукционная BMDM

  1. Ресуспендируют изолированных клеток костного мозга в питательной среде BMDM (2х10 6 клеток / мл).

BMDM питательной среде:

Исков, модифицированной по способу Дульбекко среды (IMDM) + 10% FBS + 15% фильтровали (фильтр 0,2 мкм) L-929 клетки (АТСС, CCL-1) культурального супернатанта (содержащего моноцитов колониестимулирующий фактор, M-CSF) или 10 нг / мл M -CSF.

Примечание: L-929 клетки супернатант содержит M-CSF 18. Для обеспечения эффективной активности кондиционированной среды, 5 × 10 5 L-929 клетки высевают в T75 см2 колбах в течение 6-7 дней, кондиционированную среду собирали и пропускали через 0,45 мкм фильтр перед использованием. Средний аликвоты можно использовать сразу или хранить в -80 ° С в течение 1-2 месяцев.

  1. Семенной клеток в 6 или 12-луночных планшетах для культуры тканей (в зависимости от плана эксперимента) (Corning Costar).
  2. Изменение свежую среду роста BMDM на 3 день.
  3. На 7 день, образование зрелых BMDM оценивается с помощью анализа проточной цитометриии флуорофором конъюгированных антител для обнаружения клеток, экспрессирующих CD11b и F4/80.

3. BMDM поляризованные Активация

  1. На 7 день менять на свежую среду стимуляции: для активации M1, использовать IMDM, содержащей 10% FBS и 100 нг / мл ЛПС, или 100 нг / мл ЛПС с 50 нг / мл IFN-; для M2 активации использовать IMDM, содержащей 10% FBS с 10 нг / мл IL-4 и / или 10 нг / мл IL-13.
  2. Сбор стимулировали BMDMs путем отделения их от тарелки теплой 0,05% трипсин, с последующей промывкой клетки дважды ЗФР, содержащим 10% FBS.

Примечание: Для отсоединения и ресуспендируют зрелых макрофагов после дифференцировки, 0,05% трипсина раствора (содержащего 0,48 мМ ЭДТА, Invitrogen) или 2-5 мМ ЭДТА в Са и Mg, свободный PBS или сбалансированный буфера Хенкса (HBSS), могут быть использованы. При использовании пищеварительной среды, содержащей трипсин, клетки обрабатывают при 37 ° С в течение менее 10 мин, чтобы избежать потери SurЛицо белки из-за чрезмерной пищеварения.

  1. Использование антител к детекции экспрессии антигенов клеточной поверхности, включая CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 или CD86 в различные моменты времени с использованием стандартных методов проточной цитометрии окрашивания.
  2. Определить экспрессию генов, характерных активированного M1 и M2 макрофагов в том числе IL-1β, TNF-α и IL-6 (M1 активации) или IL-10, IL-13, arginase1 и PPAR-(M2 активации) с использованием QRT-PCR. Определите активацию сигнальных путей клетки участвуют в активации М1 или М2 макрофаги помощи вестерн-блоттинга анализа.

Результаты

Схематическое описание BMDM процедура генерации представлен (Рис. 1). Высокая чистота зрелых макрофагов можно наблюдать на 7-й день, когда они представляют от 95 до 99% + F4/80 CD11b + клеток (рис. 2). Поляризованные макрофаги могут анализироваться с помощью антител против CD11b, F4/80, CD...

Обсуждение

Мы сообщаем здесь простые и легко адаптируются в пробирке процедуры, чтобы вызвать активацию макрофагов, полученных из клеток костного мозга предшественников. Эта процедура может быть использована для исследования механизмов, ответственных за поляризации макрофагов. Чистота зр...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца (BGIA 7850037 доктору Beiyan Чжоу).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech 315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

Ссылки

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

76

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены