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要約

記事は容易に簡単に適応を説明 in vitroでモデル。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

要約

記事では、マクロファージ分極を調査するためのin vitroモデルで容易に簡単に適応を説明しています。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

概要

古典的な炎症反応とは異なる、組織に浸潤したマクロファージは、多くの場合、宿主組織の生理機能を1-8の調節に重要な役割を果たしている偏光活性状態を表示します。刺激により、マクロファージの活性化は、古典的な（M1）および代替（M2）の活性化2,4,9に分類することができる。 M1マクロファージの活性化は、例えばTNF-αとし、炎症性サイトカインの産生をもたらす、Toll様受容体（TLR）および核因子カッパB（NFκB）/ c-Jun N末端キナーゼ1（JNK1）の活性化に依存するIL- 1β、例えば、窒化酸化物（NO）10、11などの反応性酸素種の産生増加をもたらすことのiNOSの活性化。対照的に、M2マクロファージ活性化リクルートPPARγ、PPARδ、またはIL-4-STAT6経路は、代替マンノース受容体CD206のアップレギュレーションと関連付けられ、抗炎症性（M2）活性化、およびアルギナーゼ1（Arg1の）6,12につながる- 14 </>（商標）。

骨髄由来マクロファージ（BMDM）は活性化マクロファージ15の偏光を制御するメカニズムを理解するためのin vitroモデル理想を提示する。 M2マクロファージの偏光IL-4および/またはIL-13によって誘導することができるながら具体的には、M1マクロファージの活性化は、リポ多糖（LPS）刺激によって誘導することができる。成熟した骨髄由来マクロファージおよび活性化マクロファージがCD11bを、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80およびCD86 9、16、17を含む表面抗原の発現についてフローサイトメトリー分析によって同定することができる。また、マクロファージ偏光に関連付けられたシグナル伝達経路のサイトカイン産生および細胞の変化は、それぞれ、定量的RT-PCRおよびウエスタンブロットによって測定することができる。要約すると、マウスの骨髄由来マクロファージは、in vitroでマクロファージ分極を研究するため、関連するモデルとしての役割を果たすことができます。

プロトコル

1。骨髄細胞の単離

  1. 6-8週齢のマウスからの大腿骨と脛骨の骨を分離し、髪を洗い流した後、骨を開いてカット。
  2. 冷PBS +2％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）（3-5 ML /マウス）に骨髄を洗い流すために21G針とを10mlのシリンジを使用してください。
  3. 細胞を解離するために21G針を4〜6回を通して骨髄を渡します。
  4. 細胞塊、骨、毛髪および他の細胞/組織を除去するために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡します。
  5. NH 4 Cl溶液（0.8％NH 4 Cl溶液、STEMCELL技術）の3つのボリュームを追加し、赤血球を除去するために10分間氷上でインキュベートする。
  6. 4℃で5分間500 xgで細胞をスピンダウン
  7. 冷PBS +2％FBS（20〜50ミリリットル、細胞の量に依存する）で細胞ペレットを再懸濁します。

2。誘導BMDM形成

  1. BMDM成長培地（2×10 6細胞/ mのに孤立した骨髄細胞を再懸濁しL）。

BMDM成長培地：

イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ 10％FBS + 15％、濾過（0.2μmの）L-929細胞（ATCC、CCL-1）培養上清（単球コロニー刺激因子、M-CSFを含む）または10 ngの/ mlのM -CSF。

注：L-929細胞上清は、M-CSF 18が含まれています。 5 X 10 5 L-929細胞は6-7日間T75センチ2フラスコに播種され、馴化培地の効果的活動を確保するために、馴化培地は、使用前にフィルター0.45μmの収集と渡されます。培地のアリコートを1〜2ヶ月のためにすぐに使用されるか、または-80°Cに保存することができます。

  1. 6または12ウェル組織培養プレート（実験デザインに応じて）（コーニングコスター）におけるシード細胞。
  2. 3日目に新鮮BMDM増殖培地を変更します。
  3. 7日目に、成熟BMDMの形成は、フローサイトメトリー分析を用いて評価されると蛍光体結合抗体の、CD11b及びF4/80を発現する細胞を検出する。

3。 BMDM偏アクティベ

  1. 7日目に、新鮮な刺激培地に変更：M1活性化のために、IMDM、50 ngの/ mlのIFNγと10％FBS、100 ngの/ mlのLPSまたは100 ngの/ mlのLPSを含む使用し、M2活性化のために、と10％FBSを含むIMDMを使用10 ngの/ mlのIL-4および/または10 ngの/ mlのIL-13。
  2. 暖かい0.05％トリプシンを用いて皿からそれらを取り外すことによって刺激さBMDMsを集め、PBS、10％FBSを含有する細胞を2回洗浄した。

注：差別、0.05％トリプシン溶液（0.48 mMのEDTA、Invitrogen社を含む）または2-5 mMのEDTAのCaおよびMgを含まないPBSまたはハンクス平衡緩衝液（HBSS）の後に成熟したマクロファージをデタッチし、再懸濁するために使用することができます。トリプシンを含む消化媒体を使用する場合、細胞はシュルの損失を避けるために10分未満、37°C​​で処理する顔はオーバー消化のためにタンパク質。

  1. 標準的なフローサイトメトリー染色手順を使用して、様々な時点でのCD11b、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80またはCD86を含む細胞表面抗原の発現を検出する抗体を使用。
  2. 定量RT-PCRを用いたIL-1β、TNF-αおよびIL-6（M1の活性化）、またはIL-10、IL-13、arginase1およびPPARγ（M2活性化）を含む活性化M1とM2マクロファージの特徴的な遺伝子の発現を決定する。ウエスタンブロット分析によってM1またはM2マクロファージの活性化に関与する細胞のシグナル伝達経路の活性化を決定します。

結果

BMDM生成手順の概略的な説明は、（ 図1）提示される。彼らはCD11bを+ F4/80 +細胞の95〜99％（ 図2）を表す場合、成熟マクロファージの高純度は、7日目に観察することができる。偏マクロファージは、フローサイトメトリー分析を行ったCD11b、F4/80、CD11c陽性およびCD206に対する抗体を用いて調べることができる。 図3に示すように、M1マクロファージとして検...

ディスカッション

ここでは、骨髄前駆細胞由来のマクロファージの活性化を誘導するためのシンプルかつインビトロで容易に適応手順を報告する。この手順は、マクロファージの偏光を担当するメカニズムの研究のために使用することができる。成熟したマクロファージの純度は、このプロトコルの平均値を95から99までパーセントを用いて得られ、追加の精製法が必要とされない。マクロファージ分極...

開示事項

利害の衝突は宣言されていない。

謝辞

この作品は、米国心臓協会（博士Beiyan周にBGIA 7850037）によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech 315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

参考文献

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