Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir açıklar In vitro modeli. GM-CSF/M-CSF varlığında, kemik iliği hematopoetik kök / progenitör hücrelerin M1 veya M2 uyarımı ile devam eden, monositik farklılaşma içine yönlendirilir. Etkinleştirme durumunu hücre yüzey antijenleri, gen ve hücre sinyal yolları değişiklikleri ile takip edilebilir.

Özet

Makalede, makrofaj polarizasyon araştırmak için in vitro model, kolayca kolayca uyarlanabilir açıklanmaktadır. GM-CSF/M-CSF varlığında, kemik iliği hematopoetik kök / progenitör hücrelerin M1 veya M2 uyarımı ile devam eden, monositik farklılaşma içine yönlendirilir. Etkinleştirme durumunu hücre yüzey antijenleri, gen ve hücre sinyal yolları değişiklikleri ile takip edilebilir.

Giriş

Klasik inflamatuar yanıtları, dokuların sızmak makrofajlar farklı genellikle konak doku fizyolojik fonksiyonları 1-8 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar polarize etkinleştirme durumunu görüntüler. Stimülasyon üzerine, makrofaj aktivasyonu klasik (M1) ve alternatif (M2) aktivasyon 2, 4, 9 içine sıralanabilir. M1, makrofaj aktivasyonu, TNF-α ve benzeri gibi enflamatuar sitokinlerin üretimine yol açan bir Toll benzeri reseptör (TLR), ve nükleer faktör kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinaz 1 (JNK1) aktivasyonu, bağlıdır, IL- iNOS 1β ve aktivasyon böyle nitrit oksit (NO), 10, 11 gibi reaktif oksijen türlerinin artan üretimi ile sonuçlanır. Bunun aksine, M2 makrofaj aktivasyonu işe PPARy, PPARd, veya IL-4-STAT6 yolları, alternatif manoz reseptörü CD206 upregülasyonunu ile ilişkili, bir anti-enflamatuar (M2) aktivasyonu ve arginaz 1 (Arg1) 6, 12, önde gelen - 14 </> Sup.

Kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDM) aktive makrofajlar 15 kutuplaşma kontrol mekanizmaları anlamak için in vitro model ideal mevcut. M2 makrofaj polarizasyon, IL-4 ve / veya IL-13 ile indüklenen edilebilir ise Özellikle, M1, makrofajların aktivasyonu, lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılması sonucu meydana edilebilir. Olgun kemik iliği kökenli makrofajlar ve aktive makrofajlar CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ve CD86 9, 16, 17 de dahil olmak üzere yüzey antijenleri, ifadesi için flow sitometri analizi ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, sitokin üretimi ve makrofaj kutuplaşma ile bağlantılı hücre sinyalizasyon yolları değişiklikler kantitatif RT-PCR ve Batı sırasıyla blot ile ölçülebilir. Özetle, fare kemik iliği kökenli makrofajlar in vitro makrofaj kutuplaşma incelemek için ilgili model olarak hizmet edebilir.

Protokol

1. Kemik İliği Hücreleri İzolasyon

  1. 6-8 haftalık farelerin femur ve tibia kemikleri izole, saç durulayın ve sonra kemik açık kesti.
  2. Soğuk PBS +% 2 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) (3-5 ml / fare) içine iliği dışarı atılması için bir 21G iğne ve 10 ml şırınga kullanın.
  3. Hücreleri ayırmak için bir 21G iğne ile 4-6 kez iliği Min.
  4. Hücre kümeleri, kemik, saç ve diğer hücre / doku kaldırmak için 70 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir.
  5. NH4CI çözeltisi (% 0.8 NH4CI çözeltisi, Kök Hücre Teknolojisi) 3 hacim eklemek ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri aşağı Spin
  7. Soğuk PBS +% 2 FBS (20-50 ml, hücre miktarına bağlı olarak) içinde hücre pelletini.

2. Indüksiyon BMDM Oluşumu

  1. BMDM büyüme ortamı içinde izole edilmiş kemik iliği hücreleri (2x10 6 hücre / a süspansel).

BMDM büyüme ortamı:

Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) +% 10 FBS +% 15 süzüldü (0.2 um), L-929 hücresi (ATCC CCL-1) kültür yüzey (monosit-koloni uyarıcı faktör, M-CSF ihtiva eden) veya 10 ng / ml 'M -CSF verildi.

Not: L-929 hücre yüzer M-CSF 18 içerir. Koşullandırılmış ortam, 5 etkin aktivitesi sağlamak için 5 x 10 L-929 hücreleri 6-7 gün boyunca T75 cm2 şişelerde tohumlanmıştır, kıvamlandırılmış ortam maddesi kullanımdan önce filtre bir 0.45 mikron ile toplanmış ve geçirilir. Orta alikotları 1-2 ay için hemen kullanılabilir ya da -80 ° C'de saklanabilir.

  1. 6 veya 12 oyuklu doku kültürü plakaları (deney tasarımına bağlı olarak) (Corning Costar) tohum hücreleri.
  2. 3. günde taze BMDM büyüme ortamı değiştirin.
  3. 7. günde, olgun BMDM oluşumu akış sitometri analizi kullanılarak değerlendirilmiştirve fluorofor konjuge antikorlar CD11b ve F4/80 ifade hücreleri algılamak için.

3. BMDM Polarize Aktivasyon

  1. 7. günde taze ortam uyarılması değiştirin: M1 aktivasyonu için, IMDM 50 ng / ml, IFNy ile,% 10 FBS ve 100 ng / ml LPS ya da 100 ng / ml LPS içeren kullanımı, M2 aktivasyonu için,% 10 FBS içeren IMDM kullanmak 10 ng / ml IL-4 ve / veya 10 ng / ml IL-13.
  2. Sıcak% 0.05 tripsin kullanarak çanak bunların ayrılması ile uyarılan BMDMs toplayın, PBS% 10 FBS içeren hücreler iki kez yıkanması takip etti.

Not: farklılaşma sonra olgun makrofajlar,% 0.05 tripsin solüsyonu (0.48 mM EDTA, Invitrogen ihtiva eden) veya Ca ve Mg-içermeyen PBS veya Hank dengeli tamponu (HBSS) içerisinde 2-5 mM EDTA ayırmak ve yeniden süspanse etmek için kullanılabilir. Tripsin içeren sindirim orta kullanırken, hücrelerin sur kaybını önlemek için en az 10 dakika süreyle 37 ° C de tedavi ediliryüz aşırı sindirim nedeniyle proteinleri.

  1. CD11b F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ya da standart akış sitometrisi boyama işlemleri kullanarak, çeşitli zaman noktalarında CD86 dahil olmak üzere hücre yüzey antijenlerinin ekspresyonunu tespit etmek için antikorların kullanımı.
  2. QRT-PCR kullanılarak, IL-1β, TNF-α ve IL-6 (M1 aktivasyonu) veya IL-10, IL-13, arginase1 ve PPARy (M2 aktivasyonu) dahil olmak üzere, aktive edilmiş makrofajlar M1 ve M2 karakteristik genlerin ekspresyonunu belirlemek. Batı blot analizi ile M1 veya M2 makrofaj aktivasyonu ile ilgili hücre sinyal yollarının aktivasyonu belirleyin.

Sonuçlar

BMDM nesil prosedürün şematik bir açıklama (Şekil 1) sunulmuştur. Onlar CD11b + F4/80 + hücreler 95% 99 (Şekil 2) temsil zaman olgun makrofaj yüksek saflıkta 7. günde görülebilir. Polarize makrofajlar CD11b, F4/80 karşı antikor kullanılarak incelenebilir, CD11c ve CD206 akım sitometri analizi ile izledi. Şekil 3 'de gösterildiği gibi, M1 makrofajlar gibi tespit edilir CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-hücrelerinin (Q2), M2 makrofajlar CD11b oysa + ...

Tartışmalar

Burada kemik iliği projenitör hücrelerinden elde edilen makrofajların aktivasyonu uyarmak için basit ve in vitro olarak kolaylıkla adapte prosedür sunulmuştur. Bu prosedür, makrofaj polarizasyon sorumlu mekanizmalarının incelenmesi için de kullanılabilir. Olgun makrofajlar saflığı bu protokolü ortalama 95 ila 99% kullanılarak elde ve ek saflaştırma işlemleri gereklidir. Makrofaj polarizasyon, ektopik ifade veya gen spesifik demonte bağlamında özel ilgi genlerin işlevine araştırmak 7. ...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (Dr Beiyan Zhou için BGIA 7.850.037) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fetal bovine serumInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech 315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm cell strainerBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-mouse CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-mouse CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

Referanslar

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 76H cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiT pGenetikBiyomedikal M hendisli ibiyoloji genelgenetik hayvan ve bitkiimm nolojiya am bilimleriYa am Bilimleri Genelmakrofaj polarizasyonkemik ili inden elde edilen makrofajak sitometrisiPCR ilebir hayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır