JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من thaliana نبات الأرابيدوبسيس البذور. ما يصل الى 40 الأجنة يمكن أن تكون معزولة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. هذا الإجراء هو مناسبة لTranscriptome على، الحامض النووي، مراسل التعبير الجيني، المناعية ومضان في الموقع تحليلات التهجين.

Abstract

في النباتات المزهرة، الجنين يتطور داخل الأنسجة مغذية - السويداء - محاطة integuments البذور الأمهات (أو معطف البذور). ونتيجة لذلك، وعزل الأجنة النباتية في المراحل المبكرة (1 الخلية إلى مرحلة كروي) يمثل تحديا تقنيا بسبب عدم إمكانية الوصول النسبية. هو ضعف كفاءة تشريح دليل في المراحل الأولى بقوة من قبل صغر حجم بذور نبات الأرابيدوبسيس الشباب والإلتصاق من الجنين إلى الأنسجة المحيطة بها. هنا، نحن تصف طريقة التي تسمح للعزلة كفاءة الأجنة نبات الأرابيدوبسيس الشباب، مما أسفر حتى 40 الأجنة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. يتم الإفراج الأجنة في عازلة العزلة عن طريق سحق البذور قليلا 250-750 مع مدقة البلاستيك في أنبوب إيبندورف. كوب microcapillary تعلق إما مختبر ماصة القياسية (عن طريق أنبوب المطاط) أو يتم استخدام microinjector التحكم هيدروليكيا لجمع الأجنة من مكان قطراتد على شريحة متعددة أيضا على ضوء المجهر المقلوب. المهارات الفنية المطلوبة هي بسيطة وقابلة للنقل بسهولة، والإعداد الأساسية لا تتطلب معدات مكلفة. الأجنة التي تم جمعها هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب مثل RT-PCR، RNA تسلسل، تحليلات الحامض النووي، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، المناعية، ومراسل المقايسات الجينات.

Introduction

ويحيط الجنين من النباتات المزهرة من السويداء، والأنسجة الغذائية المستمدة من حدث الإخصاب الثانية. ويحيط كل من الجنين والسويداء من قبل عدة طبقات الخلية من معطف البذور. هذه الأنسجة بشكل جماعي تشكيل البذور، التي تنمو داخل الفاكهة. وبالتالي، يعانون من ضعف الأنسجة وتحليلات خلية محددة من الأجنة نبات الأرابيدوبسيس بشدة بسبب عدم إمكانية الوصول لها. ومع ذلك، الأجنة في المراحل المتأخرة كروي أو في وقت لاحق نسبيا قابلة جيدا لتشريح اليدوي باستخدام الإبر التنغستن غرامة بموجب stereomicroscope، أو عن طريق تطبيق ضغط طفيف على البذور باستخدام ملقط لاستخراجها. واستخدمت هذه التقنيات بنجاح لTranscriptome على تحليلات أو التنميط epigenome مثل تهجين ميكروأري، التسلسل بيسلفيت، أو الحمض النووي الريبي التسلسل (على سبيل المثال 1-3). في المقابل، دراسات الأجنة في البيضة الملقحة إلى مرحلة كروية في وقت مبكر تظل تحديا تقنيا. حتى الآن، سوى عدد قليل من الدراسات لديهم معدل تقييمتحليلات Transcriptome على orted على الأجنة الشباب باستخدام إما تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) من الأنسجة الجنينية من أقسام البذور ثابت 4 أو استخراج دليل من الأجنة الفردية من داخل البذور باستخدام أدوات غرامة 5. ومع ذلك، معدات LCM لا تتوفر عادة واستخراج الجنين دليل في مراحل مبكرة وقتا طويلا وتتطلب مهارات تشريح الممتازة التي هي غير قابلة للتحويل بسهولة. بالإضافة إلى تحليل الجينوم واسعة، الموقع التحليلات التعبير الجيني في هي أيضا من الصعب تنفيذها على الشباب والأجنة كله يشن من نبات الأرابيدوبسيس. إلى حد ما، يمكن الإفراج الأجنة الشباب على شرائح المجهر من قبل ضغط لطيف على البذور واستخدامها لمراسل المقايسات الجين أو البروتين عن طريق الكشف المناعية (انظر على سبيل المثال 6،7). هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يسمح العزلة الجنين عالية الإنتاجية، مما يعيق التحليل الكمي.

لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول فعالة وسريعةلعزل الجنين في وقت مبكر من بذور نبات الأرابيدوبسيس التي هي بسيطة لإعداد، للتحويل بسهولة، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. المبدأ الأساسي هو سحق بلطف البذور - تشريح من siliques الشباب في أنبوب إيبندورف باستخدام مدقة البلاستيك في وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة. يتم وضع استخراج البذور في قطرات على شريحة متعددة بشكل جيد ويتم فحص لوجود الأجنة صدر في مرحلة المطلوب باستخدام مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary تعلق على microinjector أو ماصة المختبر القياسية. لتطبيقات الجزيئية، يتم غسلها مرتين من قبل الأجنة الإفراج المتكررة إلى قطرات من العازلة العزلة جديدة قبل نقلهم إلى المخزن المؤقت الوجهة في حجم الحد الأدنى. للتطبيقات الخلوي (المقايسات مراسل، المناعية، FISH)، يمكن حذف غسل الخطوات.

الأسلوب يوفر العديد من المزايا: (ط) لأنها تعود 25-40 الأجنة في ~ 45 دقيقة عن التطبيق الخلويlications أو في 3-4 ساعة لتطبيقات الجزيئية (بما في ذلك الخطوات الغسيل)، (الثاني) أنها تتيح العزلة من المراحل الجنينية محددة، (الثالث) فمن السهل نقلها إلى الأشخاص ومختبرات أخرى بسبب الإعداد لها بسيطة، (الرابع) أنه يتطلب معدات متناول الإعداد الأساسية والتي هي قابلة للترقيات، و(V) قد تم استخدامه بنجاح لمختلف التطبيقات المصب مثل RNA تسلسل 8، تحليل الجينات المحددة DNA-مثيلة 9، المقايسات مراسل (10 و Raissig وآخرون، في الإعدادية.)، والأسماك (J. Jaenisch، U. Grossniklaus، C. Baroux غير منشورة، انظر الشكل 5).

Protocol

وتتلخص الإجراء في المخطط الانسيابي هو مبين في الشكل 1. يتم عرض microcapillaries والإعداد فعال في الشكل 2 والشكل 3، ويتم عرض خطوات نموذجية من العزلة الجنين في الشكل 4.

1. المواد وإعداد الواق

1.1 سيليكون طلاء الزجاج microcapillaries

  1. وضع microcapillaries في 15 مل أنبوب فالكون مع ~ 5 مل من Sigmacote (سيغما) وعكس عدة مرات.
  2. إزالة الحل، وضع أنبوب فالكون يحتوي على الشعيرات الدموية في رقائق الألومنيوم ويخبز لهم لمدة 3 ساعة على 60 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

1.2 ~ 50-100 ميكرون الحصول قطرها نصائح microcapillary

  1. سحب 1 مم القطر الزجاج الشعيرات الدموية إما يدويا على الموقد بنسن أو باستخدام ساحبة التجارية (العمودي خيوط ساحبة أو مجتذب micropipette).
  2. استخدام الماسالقلم غيض أو شفرة لقطع غيض من سحبت الشعرية لخلق افتتاح المرجوة. حدد على شكل أفضل الشعيرات الدموية تحت المجهر ستيريو. وينبغي أن يكون افتتاح 50-100 ميكرون (الشكل 2).

1.3 إعداد الشرائح

  1. Siliconize الشرائح نظيفة من خلال تغطية جميع الآبار مع Sigmacote (~ 1 مل / الشريحة) لمدة 5 دقائق، وإزالة. خبز 3 ساعة في رقائق الألومنيوم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل متعددة أيضا شرائح زجاجية مجهرية لمدة 10 دقيقة في 10٪ SDS، 2 × 2 دقيقة في nuclease خالية من المياه (تعقيمها DEPC-ده 2 O)، 2 دقيقة في الايثانول 70٪، 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪، والهواء تجف. تتم جميع الخطوات في الجرار Coplin تعقيمها. الشرائح ويمكن إعادة استخدامه عدة مرات توفير تنظيف شامل بين كل استخدام.
  3. فقط قبل الجنين انتشار العزلة ~ 0.5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) مع ماصة على سطح كامل من كل بئر والهواء الجاف.

1.4 المجهر والإعداد الشعرية

  1. استخدام مجهر مقلوب مع 10X 20X الهدف والتكبير. تحسين النقيض من الضوء (أجنة شفافة تماما).
  2. وضع مياداة مجهرية لعقد الزجاج الشعرية بجوار المجهر. يتم توصيل الزجاج الشعرية إلى microinjector (الشكل 3A) أو إلى العادية P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط (الشكل 3B، انظر المناقشة للحصول على وصف مفصل لهذا الإعداد).
  3. ضع الشعرية فوق شريحة المجهر في زاوية ~ 70 درجة (الشكل 3) وضبط الموقف أن يكون فتحة في مجال الرؤية.
  4. قبيل العزلة الجنين يستغرق والافراج ~ 5-10 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل) لمعطف الشعرية.

1.5 المخازن المؤقتة

يسرد الجدول 1 العزلة والمقصد مخازن بالاعتماد على التطبيقات المصب.

  1. إعداد ~ 1 مل العازلة العزلة لكل عينة استخدام طازجة قبل وابقائه على الجليد.
  2. إعداد المخزن المؤقت الوجهة في مل أنبوب إيبندورف 0.5 ملزم منخفض على الجليد (تطبيقات الجزيئية) أو على شريحة المجهر (تطبيقات الخلوي) في غرفة رطبة.

2. تشريح البذور واستخراج الأجنة

2.1 المزامنة من تطوير البذور

  1. إضعاف الزهور والاحتفاظ بها 2 أيام في غرفة النمو مع تجنب الاتصال من المدقات يتعرض مع غيرها من الزهور، ثم تلقح لهم (على سبيل المثال 11).
  2. اختبار تلك المرحلة من التطور في ظل ظروف النمو الخاص بك عن طريق التحقيق المجهرية من البذور تطهيرها. مع ظروف النمو لدينا (16 ساعة ضوء في 21 ° C، 8 ساعة مظلمة عند 18 درجة مئوية والرطوبة 70٪) جمع البذور 2.5 أيام بعد التلقيح (DAP) أسفرت أساسا 2-4 أجنة الخلية والبذور التي تم جمعها 3،5-4 DAP أسفرت كروي الأجنة.

2.2 تشريح البذور وتمزق

  1. إزالة الصورةeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) تحت stereomicroscope مع ملقط وإبر الأنسولين.
  2. تزج البذور في 20 ميكرولتر العازلة العزلة في 2 مل جولة القاع أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
  3. سحق بلطف البذور مع مدقة البلاستيك (قبل تنظيفها مع 10٪ SDS، تشطف مع DEPC-ده 2 O وغسلها مع الايثانول 70٪) للافراج عن الأجنة حتى استخراج البذور هو غائم. القوة لتقديم الطلبات هو يحدده كل مستخدم على المحاكمة.
  4. شطف مدقة مع 300 ميكرولتر من العازلة العزلة لغسل مدقة وتمييع العينة.
  5. تدور باستمرار استخراج في 5،000 x ج لمدة 5 ثوانى. resuspend بلطف استخراج مكعبات من قبل pipetting صعودا ونزولا 2-3 مرات.
  6. تحديد استخراج مع شبكة من النايلون 30 ميكرومتر (التي شنت على محولات أنبوب، على سبيل المثال من PartecCelltricks). شطف شبكة مع 200 العازلة ميكرولتر إضافية العزلة.

3. عزل الجنين

3.1 إعداد الشرائح

    <لى> مكان نظيف والشرائح المتعددة جيدا BSA المغلفة وsiliconized على مسرح المجهر المقلوب، resuspend واستخراج البذور تمت تصفيتها من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا وماصة 2 قطرات من 40-50 ميكرولتر استخراج البذور في 1 أو 2 الآبار . فحص فقط 1 أو 2 قطرات في وقت يمنع التبخر من العينة.
  1. مكان 50 ميكرولتر من العازلة العزلة الطازجة (1 شارع انخفاض غسل) في بئر من شريحة مختلفة أعدت كما كان من قبل. إبقاء هذه الشريحة في غرفة تجارة وصناعة المغطاة الرطبة لمنع التبخر.

3.2 الشاشة، وتنظيف، وجمع

  1. فحص قطرات من استخراج البذور من أجل أجنة في مرحلة المطلوب مع هدف التكبير 10x. إذا لزم الأمر، تأكيد المسرح مع التكبير 20X. الأجنة عادة تنزل الى القاع من الشريحة.
  2. إزالة يدويا الحطام حول الجنين مع إبرة التنغستن، إبرة الأنسولين أو معدات مماثلة.
  3. نقل الزجاج الشعرية بالقرب من جنين باستخدام مياداة مجهرية، رأك يصل الجنين مع كحل أقل قدر ممكن.
  4. جمع العديد من الأجنة (على سبيل المثال كل من القطيرات واحدة) وإطلاق سراحهم في 1 شارع انخفاض غسل (تطبيق الجزيئية) أو في المخزن المؤقت الوجهة (تطبيقات الخلوي). يجب أن تبقى كل جولة جمع في غضون 5-10 دقيقة وينبغي جمع الأجنة في حجم الحد الأدنى (الحجم الكلي للجميع الجولات جمع يجب أن يكون <5 ميكرولتر).
  5. تكرار الفحص وجمع حتى يتم جمع المبلغ المطلوب من الأجنة في 1 شارع انخفاض غسل (مركزيا، إذا كان ذلك ممكنا، لتسهيل تذكر).
  6. يتذكر جميع الأجنة في آن واحد من قطرة غسل (إذا نفذت أكثر من الحطام، إزالتها بإبرة قبل تذكر).
  7. الإفراج عن الأجنة إلى قطرة غسل الثانية 2 من 50 ميكرولتر. كرر 3.2.6.
  8. الإفراج عن الأجنة في المخزن المؤقت الوجهة. نقل وينبغي أن تشمل فقط الاتصال، وليس الغمر، من طرف الشعرية.
  9. استبدال microcapilلاري للعينة القادمة.

النتائج

لدينا إجراء العزل الجنين (الشكل 1) يسمح العزلة لمدة تصل إلى 40 الأجنة في 4 ساعة إذا يتم تنفيذ يغسل، وعلى سبيل المثال لتطبيقات الجزيئية، أو في أقل من ساعة إذا تم حذف يغسل، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. يعرض الشكل 2 العالية والمنخفضة نصائح mi...

Discussion

وضعنا بروتوكولا العزلة الجنين الذي هو سريع، فعال، ويمكن نقلها بسهولة إلى مختبرات أخرى.

المعدات وصفها هنا يتكون من مجهر مقلوب، وهو مياداة مجهرية، زجاج microcapillaries، مجتذب خيوط الرأسي وmicroinjector (الشكل 3A). الإعداد هو مماثلة لتل?...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

ونود أن نشكر تل ناوي ومارتن باير لنصائحهم على العزلة الجنين. MTR، VG، UG وCB ابتكر أجهزة العزلة الجنين. وضعت MTR، VG وCB بروتوكول العزلة الجنين. أنشئت MTR، VG وCB البروتوكول، عزل الأجنة، والجنين ولدت [كدنا]، ينجز VG على JJ PCR، MTR تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، والتجارب على الأسماك. MTR، VG، CG وUG كتب مخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة زيوريخ، وزمالة من مؤسسة أبحاث روش (لMTR)، والمنح المقدمة من المؤسسة السويسرية الوطنية (لUG وCB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
SigmacoteSIGMASL2-100 ml
RNAse OUTInvitrogen (life technologies)10777-019
First- strand bufferInvitrogen (life technologies)18064-022contained in Superscript II package
DTTInvitrogen (life technologies)18064-022contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml New England Biolabs Inc.Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mmWorld Precision InstrumentsTW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 mlVaudaux-Eppendorf0030108.035
CellTricsΔ 30 μmPARTEC04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slidesElectron Microscopy Sciences63421-10
Formaldehyde SolutionSigma-AldrichF1635
Superfrost Plus slideThermo FisherJ1800AMNZMenzel-Gläser
TrisAmaresco0497
EDTAApplichemA2937
GlycinFluka50050
SDS pelletsRothCN30.3
Micro PestleVWR431-0094
Microfine insulin syringesBDU-100
DEPCSigma-AldrichD5758
EthanolSchaurlauET00102500
Forceps N5Dumont0108-5
Bioanalyzer Pico ChipAgilent Technologies5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscopeNikon TMS (Japan),
MicromanipulatorLeitzLeica
Micomanipulator Post mount LH1 probeLeica microsystems39430101Different brand will also do the work
Vertical filament pullerSutter instrumentP-20 modelOther model are also suitable
Cell Tram varioVaudaux-Eppendorf5176.000.033
BioanalyzerAgilent Technologies2100
Qubit FluorometerInvitrogen (life technologies

References

  1. Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
  2. Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
  3. Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
  4. Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
  5. Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
  6. Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
  7. Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
  8. Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
  9. Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
  10. Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
  11. Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
  12. Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
  13. Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
  14. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
  15. Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
  16. Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
  17. Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 thaliana RNA transcriptomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved