Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

Resumen

Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo desde Arabidopsis thaliana Semillas. Hasta 40 embriones se pueden aislar en 1 hora a 4 horas, dependiendo de la aplicación aguas abajo. El procedimiento es adecuado para transcriptoma, la metilación del ADN, la expresión del gen reportero, inmunotinción y fluorescencia In situ Análisis de hibridación.

Resumen

En las plantas con flores, el embrión se desarrolla dentro de un tejido nutritivo - el endospermo - rodeado por los tegumentos de semillas materna (o cubierta de la semilla). Como consecuencia de ello, el aislamiento de los embriones de la planta en las primeras etapas (1 celda a la etapa globular) es técnicamente difícil, debido a su relativa inaccesibilidad. La disección manual de eficiente en las primeras etapas está fuertemente afectada por el pequeño tamaño de jóvenes semillas de Arabidopsis y la adhesividad del embrión a los tejidos circundantes. Aquí, se describe un método que permite el aislamiento eficiente de pequeños embriones de Arabidopsis, un rendimiento de hasta 40 embriones en 1 hora a 4 horas, dependiendo de la aplicación aguas abajo. Los embriones se liberan en tampón de aislamiento por aplastamiento ligeramente 250-750 semillas con una mano de mortero de plástico en un tubo Eppendorf. Un vaso capilar se adjunta a una pipeta de laboratorio estándar (a través de un tubo de goma) o una microinyector mando hidráulico se utiliza para recoger los embriones de un lugar gotitasd en un portaobjetos de pocillos múltiples en un microscopio de luz invertida. Las habilidades técnicas requeridas son simples y fáciles de transferir, y la configuración básica no requiere de equipos costosos. Embriones recogidos son adecuados para una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como RT-PCR, secuenciación de ARN, análisis de metilación del ADN, hibridación fluorescente in situ (FISH), la inmunotinción, y ensayos de genes informadores.

Introducción

El embrión de plantas con flores está rodeado por el endosperma, un tejido nutritivo derivado de un segundo evento de la fertilización. Tanto el embrión y el endospermo están rodeadas por varias capas de células de la cubierta de la semilla. Colectivamente estos tejidos forman una semilla, que se desarrollan en el interior de la fruta. Por lo tanto, el tejido y los análisis específicos de células de embriones de Arabidopsis están fuertemente deteriorados por razón de su inaccesibilidad. Sin embargo, los embriones en las fases finales de globulares o temprano son relativamente susceptibles a la disección manual con el uso de agujas finas de tungsteno bajo el microscopio estereoscópico, o aplicando una ligera presión sobre la semilla utilizando pinzas para extraerlos. Tales técnicas se utilizaron con éxito para el análisis de perfiles de transcriptoma o epigenoma tales como microarrays de hibridación, secuenciación de bisulfito, o la secuencia de ARN (por ejemplo, ^1-3). Por el contrario, los estudios de embriones en el cigoto a la etapa globular temprana siguen siendo un desafío técnico. Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han repanálisis de transcriptoma orted en embriones jóvenes que utilizan ya sea microdisección de captura por láser (LCM) de tejidos embrionarios de semillas secciones fijas ⁴ o extracción manual de los embriones individuales desde dentro de las semillas utilizando herramientas finas ^5. Sin embargo, equipos de LCM no está comúnmente disponible y la extracción manual de embriones en las primeras etapas es mucho tiempo y que requiere excelentes habilidades de disección que no son fácilmente transferibles. Además de los análisis de todo el genoma, en el análisis de expresión génica in situ también son difíciles de realizar en los jóvenes, todo el montaje embriones de Arabidopsis. Hasta cierto punto, los embriones jóvenes pueden ser liberados en portaobjetos de microscopio por una suave presión sobre las semillas y se utilizan para ensayos de genes informadores o la detección de proteínas mediante inmunotinción (por ejemplo, véase ^6,7). Esta técnica, sin embargo, no permite el aislamiento de embriones de alto rendimiento, lo que dificulta los análisis cuantitativos.

Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente y rápidapara el aislamiento del embrión a partir de semillas de Arabidopsis que es fácil de configurar, fácil de transferir, y adecuado para una variedad de aplicaciones posteriores. El principio básico es machacar suavemente las semillas - disecado de silicuas jóvenes en un tubo Eppendorf con una mano de mortero de plástico en un tampón de aislamiento adecuado. El extracto de la semilla se coloca en gotas sobre un portaobjetos de múltiples pocillos y se analiza para detectar la presencia de embriones liberados en la etapa deseada usando un microscopio invertido. Los embriones se recogieron usando un vaso capilar se une a un microinyector o una pipeta de laboratorio estándar. Para aplicaciones moleculares, los embriones se lavan dos veces por la liberación repetida en gotas de nuevo tampón de aislamiento antes de transferirlos a la memoria intermedia de destino en un volumen mínimo. Para aplicaciones citológicas (reportero ensayos, inmunotinción, pescado), etapas de lavado se pueden omitir.

El método ofrece varias ventajas: (i) que produce 25-40 embriones en ~ 45 min para aplicación citológicocaciones o en 3-4 horas para aplicaciones moleculares (incluyendo los pasos de lavado), (ii) que permite el aislamiento de las etapas embrionarias específicas, (iii) que es fácilmente transferible a otras personas y laboratorios debido a su configuración sencilla, (iv) requiere un equipo asequible para la configuración básica que es susceptible de mejoras, y (v) que se utilizó con éxito para diversas aplicaciones aguas abajo, tales como la secuenciación de ARN ^8, el análisis de la metilación del ADN de genes específicos de ^9, los ensayos de reportero ⁽¹⁰ y Raissig et al., en prep.) y FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédita, ver Figura 5).

Protocolo

El procedimiento se resume en el diagrama de flujo mostrado en la Figura 1. El microcapilares y la configuración instrumentales se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, y los pasos típicos de aislamiento embrión se muestran en la Figura 4.

1. Material y Preparación Tampón

1.1 silicio de revestimiento de vidrio microcapilares

1. Coloque el microcapilares en un tubo Falcon de 15 ml con 5 ~ ml de Sigmacote (Sigma) y se invierte varias veces.
2. Retirar la solución, colocar el tubo Falcon que contiene los capilares en una lámina de aluminio y hornear durante 3 horas a 60 ° C. Guarde a temperatura ambiente.

1.2 Obtención de ~ 50 a 100 micras de diámetro consejos microcapilares

1. Tire de 1 mm de diámetro capilares de vidrio, ya sea manualmente sobre un mechero Bunsen o mediante el uso de un extractor comercial (vertical filamento extractor o extractor de micropipeta).
2. Utilice un diamantela punta del lápiz o cuchilla para cortar la punta del capilar tirado para crear la abertura deseada. Seleccione la mejor forma de capilares bajo un microscopio estereoscópico. La abertura debe ser de 50-100 micras (Figura 2).

1.3 Preparación del portaobjetos

1. Siliconize portaobjetos limpios, cubriendo todos los pocillos con Sigmacote (~ 1 ml / diapositiva) durante 5 min, eliminar. Hornear 3 hr en papel de aluminio. Guarde a temperatura ambiente.
2. Lavar los pocillos múltiples portaobjetos de microscopio de vidrio durante 10 min en 10% de SDS, 2 x 2 min en agua libre de nucleasa (autoclave DEPC-ddH ₂ O), 2 min en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 100%, con aire secar. Todos los pasos se realizan en jarras Coplin autoclave. Las diapositivas se pueden volver a utilizar varias veces proporcionando una limpieza a fondo entre cada uso.
3. Justo antes de la propagación aislamiento embrión ~ 0,5 l de 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) con una pipeta sobre toda la superficie de cada pocillo y secar al aire.

1.4 Microscopio y configuración capilar

1. Utilice un microscopio invertido con un 10x y 20x objetivo de aumento. Optimice el contraste de la luz (embriones son bastante transparentes).
2. Coloque un micromanipulador para sujetar el capilar de vidrio al lado del microscopio. El capilar de vidrio está conectado a un microinyector (Figura 3A) o a un habitual P-200 pipeta a través de un tubo de goma (Figura 3B, véase la discusión para una descripción detallada de esta configuración).
3. Coloque el capilar por encima del portaobjetos de microscopio en un ángulo de ~ 70 ° (figura 3) y ajustar la posición de tener la abertura en el campo de visión.
4. Justo antes del aislamiento de embriones absorber y liberar ~ 5-10 l BSA (1 mg / ml) para cubrir el capilar.

1.5 Buffers

La Tabla 1 enumera los tampones de aislamiento y de destino en función de las aplicaciones posteriores.

1. Prepare ~ 1 ml de tampón de aislamiento por muestra justo antes de su uso y mantener en hielo.
2. Preparar el tampón de destino en un tubo de baja de unión a 0,5 ml Eppendorf en hielo (aplicaciones moleculares) o en un portaobjetos de microscopio (aplicaciones citológicas) en una cámara húmeda.

2. Disección Semilla y Extracción de Embriones

2.1 Sincronización de Mejoramiento de Semillas

1. Emasculate flores y mantenerlos 2 días en la cámara de crecimiento, mientras que evitando el contacto de los pistilos expuestas con otras flores, a continuación, polinizar ellos (por ejemplo, ^11).
2. Prueba de la etapa de desarrollo bajo sus condiciones de crecimiento mediante la investigación microscópica de semillas despejadas. Con nuestras condiciones de crecimiento (16 horas de luz a 21 ° C, 8 horas de oscuridad a 18 ° C y 70% de humedad) semillas recogieron 2,5 días después de la polinización (DAP) produjeron principalmente 2-4 células de embriones y semillas recogieron 3,5-4 DAP produjo globular embriones.

2.2 Disección Semillas y Ruptura

1. Retire la sEEDS 10-15 silicuas (~ 2,5 DAP) bajo un microscopio estereoscópico con pinzas y agujas de insulina.
2. Sumerja las semillas en 20 tampón de aislamiento l en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2 ml se coloca en hielo.
3. Aplastar suavemente las semillas con una mano de mortero de plástico (previamente limpiada con 10% de SDS, se enjuagó con DEPC-ddH ₂ O y se lavó con etanol al 70%) para liberar los embriones hasta que el extracto de semilla está nublado. La fuerza a aplicar debe ser determinado por cada usuario al ensayo.
4. Enjuagar el mortero con 300 l de tampón de aislamiento para lavar la mano del mortero y diluir la muestra.
5. Spin-hacia abajo el extracto a 5000 xg durante 5 seg. Resuspender suavemente el extracto de sedimento con la pipeta hacia arriba y abajo 2-3 veces.
6. Filtrar el extracto con 30 micras de malla de nylon (montado en adaptadores de tubo, por ejemplo, de PartecCelltricks). Enjuague la malla con un tampón de aislamiento adicional de 200 l.

3. Aislamiento de embriones

3.1 Preparación del portaobjetos

1. Colocar un portaobjetos de pocillos múltiples limpio, BSA recubierto y siliconado sobre la platina del microscopio invertido, resuspender el extracto de semilla de filtrado por pipeteado suavemente hacia arriba y hacia abajo y pipetear 2 gotas de extracto de semilla de 40-50 l en 1 o 2 pozos . El cribado sólo 1 o 2 gotas a la vez evita la evaporación de la muestra.
2. Lugar 50 l de tampón de aislamiento fresca (1 ^st gota lavado) en un pocillo de una diapositiva diferente preparado como antes. Conserva esta diapositiva en una cámara cubierta y húmeda para evitar la evaporación.

3.2 pantalla, limpiar, recoger

1. Pantalla de las gotas de extracto de semilla de embriones en la etapa deseada con el objetivo de 10 aumentos. Si es necesario, confirme el escenario con 20 aumentos. Los embriones generalmente se hunden en la parte inferior de la corredera.
2. Eliminar manualmente los desechos alrededor del embrión con una aguja de tungsteno, una aguja de insulina o un equipo similar.
3. Mueva el capilar de vidrio cerca del embrión utilizando el micromanipulador, take el embrión con el mínimo posible de solución.
4. Recoge varios embriones (por ejemplo, todos de una gota) y liberarlos en la 1 ^ª caída de lavado (solicitud molecular) o en el búfer de destino (aplicaciones citológicas). Cada ronda de recolección debe mantenerse dentro de 5-10 min y embriones deberán ser recogidos en un volumen mínimo (el volumen total de todas las rondas de recolección debe ser <5 l).
5. Repita la selección y recolección hasta que la cantidad deseada de embriones se recoge en la 1 ^ª caída de lavado (en el centro, si es posible, para facilitar la recolección).
6. Recordar todos los embriones a la vez desde la caída de lavado (si los residuos se llevan encima, quitar con una aguja antes de recogimiento).
7. Suelte los embriones en una 2 ^ª caída de lavado de 50 l. Repita 3.2.6.
8. Suelte los embriones en el búfer de destino. La transferencia debe implicar sólo un contacto y no inmersión de la punta capilar.
9. Vuelva a colocar la microcapilLary para la siguiente muestra.

Resultados

Nuestro procedimiento de aislamiento del embrión (Figura 1) permite el aislamiento de hasta 40 embriones en 4 horas si se procede con los lavados, por ejemplo, para aplicaciones moleculares, o en menos de una hora si lavados se omiten, por ejemplo, para aplicaciones de citológicos. Figura 2 muestra alta y baja consejos microcapilares de calidad y la Figura 3 muestra la configuración de la máquina de aislamiento de embrión. Figura 4

Discusión

Hemos desarrollado un protocolo de aislamiento embrión que es rápida, eficaz, y se puede transferir fácilmente a otros laboratorios.

El equipo descrito aquí consiste en un microscopio invertido, un micromanipulador, vidrio microcapilares, un extractor de filamento vertical y un microinyector (Figura 3A). La configuración es similar a la descrita para el aislamiento de células animales solo para los análisis de transcriptómica ^17. También trabajamos con é...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies