에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

요약

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한 방법을보고 애기 장대 씨앗. 최대 40 배아 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간으로 격리 할 수​​ 있습니다. 절차는 DNA 메틸화, 리포터 유전자 발현, 면역 염색 및 형광 사체에 적합합니다 현장에서 교잡 분석.

초록

배유 - - 임산부 씨 integuments (또는 종피)에 의해 둘러싸여 현화 식물에서 배아 영양 조직 내에서 개발하고 있습니다. 결과적으로, 초기 단계 (구상 단계 1 셀)에서 식물의 배아의 분리가 기술적으로 상대적인 어려움으로 인해 도전합니다. 초기 단계에서 효율적인 수동 박리 강력 젊은 애기 씨의 작은 크기와 주변 조직에 배아의 부착에 의해 손상된다. 여기, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간 40 배아까지 항복, 젊은 애기 태아의 효율적인 분리를 허용하는 방법을 설명합니다. 배아는 약간 에펜 도르프 튜브에 플라스틱와 유 봉, 250-750 씨앗을 분쇄하여 분리 버퍼에 해제됩니다. 유리는 표준 실험실 피 펫 중 하나에 연결 microcapillary (고무 튜브를 통해) 또는 유압 제어 microinjector은 방울 곳에서 배아를 수집하는 데 사용됩니다거꾸로 광학 현미경에 다 잘 슬라이드 라. 필요한 전문 기술은 간단하고 쉽게 양도 할 수 있으며, 기본 설정 값 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 수집 된 배아는 RT-PCR, RNA 서열, DNA 메틸화 분석, 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 면역 염색 및 리포터 유전자 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합합니다.

서문

현화 식물의 배아는 배젖, 두 번째 수정 이벤트에서 파생 된 영양 조직으로 둘러싸여 있습니다. 모두 배아와 배유가 종피의 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 종합적으로 이러한 조직은 과일 내부 개발 종자를 형성한다. 따라서, 조직 및 애기 장대 배아의 세포 별 분석은 강력하게 자신의 어려움으로 인해 손상됩니다. 그럼에도 불구하고, 늦은 구형 또는 이후 단계에서 배아는 비교적 잘 입체 현미경 하에서 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 수동으로 해부 의무, 또는 그들을 추출하는 집게를 사용하여 초기에 약간의 압력을 적용하여 있습니다. 이러한 기술은 성공적으로 사체 또는 마이크로 어레이 하이브리드, 바이 설 파이트 시퀀싱, 또는 RNA 시퀀싱 (예 ^1-3)으로 epigenome 프로파일 분석에 사용 하였다. 반면, 초기 구상 단계에 수정란에서 배아의 연구는 기술적으로 도전 남아있다. 지금까지 몇 연구 담당자가고정 씨앗 섹션 ⁴ 좋은 도구 ^5를 사용하여 종자 내에서 개별 배아의 수동 추출에서 배아 조직 중 하나 레이저 캡처 microdissection을 (LCM)를 사용하여 젊은 배아 orted 사체 분석. 그러나 LCM 장비 초기 단계에서 일반적으로 사용되는 수동 배아 추출되지 않습니다 것은 시간이 쉽게 양도 할 수 없습니다 뛰어난 절개 기술을 소모하고 필요로하는 것입니다. 게놈 넓은 분석뿐만 아니라, 현장에서 유전자 발현 분석도 애기 장대의 젊은, 전체 마운트의 배아에서 수행하기가 어렵습니다. 어느 정도 젊은 배아는 씨앗 부드러운 압력에 의해 현미경 슬라이드에 해제 할 수 있습니다 (예를 들어 ^{6,7 참조)} 면역 염색하여 리포터 유전자 분석 또는 단백질 검출에 사용됩니다. 이 기술은, 그러나, 따라서 정량 분석​​을 방해, 높은 처리량 배아 분리를 허용하지 않습니다.

그러므로, 우리는 효율적이고 빠른 프로토콜을 개발쉽게 양도 및 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합한 설정이 간단하고 애기 장대 씨앗에서 초기 배아 분리합니다. 적절한 분리 버퍼에 플라스틱 유봉을 사용하여 에펜 도르프 튜브에 젊은 siliques에서 해부 - 기본 원칙은 부드럽게 씨앗을 분쇄하는 것입니다. 종자 추출물은 다 잘 슬라이드에 방울에 배치되어 거꾸로 현미경을 사용하여 원하는 단계에서 출시 된 배아의 존재 여부를 검사합니다. 배아는 유리 microinjector 또는 표준 실험실 피펫에 부착 microcapillary 사용하여 수집됩니다. 분자 응용 프로그램의 경우, 배아는 최소한의 볼륨에서 대상 버퍼로 전송하기 전에 새로운 절연 버퍼의 방울에 반복 릴리스 회 세척한다. 세포 학적 응용 프로그램 (기자 분석, 면역 염색, FISH)의 경우, 세척 단계는 생략 할 수 있습니다.

방법은 여러 가지 장점을 제공합니다 : (i)는 세포 학적 응용을위한 45 분 ~에 25-40 배아를 산출분자 응용 프로그램 (세척 단계 포함) lications 3-4 시간에서, (II) 그것은 특정 배아 단계의 분리는, (III)는 (IV), 쉽게 단순 설정에 따라 다른 사람과 실험실에 양도 할 수 있습니다 , 업그레이드에 대한 의무가 기본 설정을위한 저렴한 장비를 필요로하고, (v)이 성공적으로 RNA 염기 서열 ^8, 유전자의 특정 DNA 메틸화 분석 ^9, 기자 분석 ⁽¹⁰ Raissig 등. 등 다양한 다운 스트림 응용 프로그램에 사용 된 의 준비.) 및 FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux되지 않은,)는 그림 5를 참조하십시오.

프로토콜

절차는 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. microcapillaries과 악기 설정은 그림 2와 그림 3에 표시되고, 배아 분리의 일반적인 단계는 그림 4에 표시됩니다.

1. 재료 및 버퍼 준비

유리 microcapillaries 1.1 실리콘 코팅

1. Sigmacote (시그마)의 ~ 5 ml의 15 ML 팔콘 튜브에 microcapillaries를 놓고 여러 번 반전.
2. 용액을 제거, 60 ℃에서 알루미늄 호일에 모세 혈관을 포함 팔콘 튜브를 배치하고 3 시간을 위해 그들을 구울 상온에서 보관하십시오.

1.2 ~ 50-100 μm의 직경 microcapillary 정보를 얻을

1. 수동 분젠 버너를 통해 또는 상용 풀러 (수직 필라멘트 끌어 당기는 사람 또는 micropipette의 풀러)를 사용하여 하나 1mm 직경의 유리 모세관을 당기십시오.
2. 다이아몬드를 사용팁 펜이나 원하는 구멍을 만들 뽑아 모세관의 끝 부분을 잘라 블레이드. 스테레오 현미경 제일 모양의 모세 혈관을 선택합니다. 오프닝은 50 ~ 100 μm의 (그림 2)이어야한다.

1.3 슬라이드 준비

1. 5 분 Sigmacote (~ 1 ML / 슬라이드) 모든 우물을 커버하여 깨끗한 슬라이드를 Siliconize, 제거합니다. 알루미늄 호일 빵 3 시간. 상온에서 보관하십시오.
2. 10 % SDS, nuclease가없는 물에 2 × 2 분 (DEPC-DDH ₂ O를 압력 가마로 소독), 70 % 에탄올에서 2 분, 100 % 에탄올에 2 분에서 10 분 동안 다 잘 유리 현미경 슬라이드를 씻어 공기 건조. 모든 단계는 멸균 코 플린 단지에서 수행됩니다. 슬라이드는 각각의 사용과 철저한 청소를 제공하는 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.
3. 직전 배아 분리 확산 ~ 10 0.5 μL MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 각 잘 공기 건조의 전체 표면에 피펫.

1.4 현미경 및 모세관 설정

1. 10X 및 20X 배율 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 빛의 명암을 최적화 (배아는 매우 투명).
2. 현미경 옆에있는 모세관 유리를 보유하는 micromanipulator에 놓습니다. 모세관 유리 고무 튜브를 통해 microinjector (그림 3A) 또는 일반 P-200 피펫에 연결되어 있습니다 (그림 3B,이 설정에 대한 자세한 설명은 설명을 참조하십시오).
3. ~ 70 ° 각도에서 현미경 슬라이드 (그림 3) 위의 모세 혈관을 배치하고 시야의 구멍을 가지고 위치를 조정합니다.
4. 직전 배아 분리를 차지 해제 ~ ~ 10 ㎕의 BSA (1 MG / ML) 코트 모세관을합니다.

1.5 버퍼

표 1은 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리 및 대상 버퍼를 보여줍니다.

1. ~ 샘플 당 1 ML 절연 버퍼 갓 전에 사용하고 얼음에 보관 준비.
2. 얼음 (분자 응용 프로그램) 또는 습기 챔버 현미경 슬라이드 (세포 학적 응용 프로그램)에서 0.5 ML Eppendorf의 낮은 바인딩 튜브 대상 버퍼를 준비합니다.

2. 씨앗 해부 및 배아 추출

종자 개발 2.1 동기화

1. 꽃 거세와 다른 꽃과 노출 암술의 접촉을 피하면서 그 성장 챔버 2 일 보관 후, 그들 (예 : ¹¹⁾ 수분.
2. 취소 씨의 현미경 조사하여 성장 조건에 따라 개발 단계를 테스트합니다. 4 DAP는 구상 굴복 - 우리의 성장 조건에 씨앗 (DAP) 수분 후 2.5 일 수집 (21에서 16 시간 빛 ° C, 18, 어두운 8 시간 ° C 및 70 % 습도) 주로 2-4 배아와 씨앗은 3.5 수집 나왔고 배아.

2.2 씨의 해부 및 파열

1. 의 제거를포셉과 인슐린 바늘 입체 현미경 하에서 15 siliques (~ 2.5 DAP)에서 eeds.
2. 얼음에 배치 2 ㎖ 둥근 바닥 에펜 도르프 튜브에 20 ㎕의 절연 버퍼에 씨앗을 담가.
3. 조심스럽게 씨앗 추출물 흐린 때까지 배아를 풀어 플라스틱 유봉 (DEPC-DDH ₂ O로 세척, 10 % SDS로 미리 청소하고 70 % 에탄올로 세척)에 씨앗을 분쇄. 적용 할 힘은 재판시 모든 사용자에 의해 결정되어야한다.
4. 유봉을 씻어 샘플을 희석 분리 버퍼 300 μL와 유봉을 씻어.
5. 스핀 다운 5 초 동안 5,000 XG에서 추출합니다. 부드럽게 위아래 2 ~ 3 번 pipetting하여 펠렛 추출물을 resuspend을.
6. 30 μm의 나일론 메쉬 (PartecCelltricks에서 예를 들어, 튜브 어댑터에 장착)와 추출물을 필터링합니다. 추가 200 μL 절연 버퍼 메쉬를 씻어.

3. 배아 분리

3.1 슬라이드 준비

<리> 장소 거꾸로 현미경의 무대에 깨끗하고, BSA 코팅 및 실리콘 처리 다 잘 슬라이드 위아래로 부드럽게 pipetting하여 필터링 씨 추출물을 resuspend을 1 또는 2 우물에 40-50 μL 씨 추출물 2 방울을 피펫 . 한 번에 1 ~ 2 방울을 선별하여 샘플의 증발을 방지합니다.
1. 이전으로 준비 다른 슬라이드의 잘에 신선한 격리 버퍼의 장소 50 μL ⁽¹ 차 ^세척 드롭). 증발을 방지하기 위해 덮인, 습기 챔버에이 슬라이드를 유지합니다.

3.2 스크린, 청소, 수집

1. 10X 배율 목적으로 원하는 단계에서 배아 종자 추출물의 방울을 화면. 필요한 경우, 20 배 배율로 단계를 확인합니다. 태아는 일반적으로 슬라이드의 바닥에 가라.
2. 수동 텅스텐 바늘, 인슐린 바늘 또는 이와 유사한 장비와 배아 주위에 파편을 제거합니다.
3. micromanipulator에, T를 사용하여 배아 근처 모세관 유리를 이동가능한 적은 솔루션으로와 배아까지 아케.
4. 여러 개의 배아를 (예를 들어, 모두 한 방울의) 수집 및 ¹ 차 ^세척 드롭 (분자 응용 프로그램) 또는 대상 버퍼 (세포 학적 응용 프로그램)에서 그들을 놓습니다. 각 수집 라운드 최소 볼륨 (모든 수집 라운드의 총 볼륨이 <5 μL이어야한다)에서 수집해야 5-10 분, 배아 내에서 유지되어야한다.
5. 배아의 원하는 양 (중앙, 가능하면 기억을 용이하게하기 위해) ¹ 차 세척 드롭 수집 될 때까지 검사와 컬렉션을 반복합니다.
6. 세척 드롭 (파편이 이월 된 경우, 기억하기 전에 바늘을 제거)에서 한 번에 모든 배아를 채취.
7. 50 μL의 2 ^{차 세척} 드롭으로 배아를 놓습니다. 3.2.6 반복합니다.
8. 대상 버퍼에 배아를 놓습니다. 전송은 모세관 끝의 유일한 접촉, 그리고 침수를 포함해야합니다.
9. microcapil를 교체다음 샘플을 위해 라히.

결과

세척이 분자 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 수행하는 경우에 우리의 배아 분리 절차 (그림 1) 4 시간 40 배아까지의 분리를 허용하거나, 시간 미만의 세척은 생략 세포 학적 응용 프로그램의 예 경우. 그림 2는 표시 높고 낮은 품질 microcapillary 팁과 그림 3은 배아 분리 시스템의 설정을 보여줍니다. 그림 4는 거꾸로 현미경에서 배아 ?...

토론

우리는 효과적인 급속 배아 분리 프로토콜을 개발, 쉽게 다른 실험실로 전송 될 수 있습니다.

여기에 설명 된 장비는 거꾸로 현미경, 미세 조작기, 유리 microcapillaries, 수직 필라멘트 풀러와 microinjector (그림 3A)으로 구성되어 있습니다. 설치가 전사 체학 분석 ¹⁷ 한 동물 세포 분리에 대해 설명한 것과 비슷합니다. 우리는 또한 성공적으로 유리 microcapillaries?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies