Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Özet

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor Arabidopsis thaliana Tohum. En fazla 40 embriyo alt uygulamaya bağlı olarak 1 saat ile 4 saat içinde izole edilebilir. Prosedür, DNA metilasyonu, muhabiri gen, immün ve floresan transcriptome için uygundur In situ Melezleme analizleri.

Özet

Endosperm - - anne tohum integuments (ya da tohum kabuğu) ile çevrili çiçekli bitkiler olarak, embriyo besleyici bir doku içinde gelişir. Sonuç olarak, erken dönemde (küresel sahneye 1 hücre) de bitki embriyoların izolasyonu teknik göreli erişilememesi nedeniyle zordur. Erken aşamalarında Verimli manuel diseksiyon güçlü genç Arabidopsis tohumların küçük boyutlu ve çevre dokulara embriyonun yapışma tarafından bozulur. Burada, biz aşağı uygulamaya bağlı olarak, 1 saat ile 4 saat içinde 40 embriyolar kadar verimli, genç Arabidopsis embriyoların verimli izolasyon sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Embriyolar, hafif bir Eppendorf tüpü içinde plastik bir havan tokmağı ile 250-750 tohum ezilmesi izolasyon tampon salınır. Bir cam standart laboratuvar pipet ya bağlı microcapillary (bir lastik tüp ile) veya hidrolik kontrollü mikroenjektör damlacıkları yerden embriyo toplamak için kullanılırters ışık mikroskobu çok iyi slayt d. Gerekli teknik beceri basit ve kolay transfer edilebilir ve temel kurulum pahalı ekipman gerektirmez. Toplanan embriyolar gibi RT-PCR, RNA sekansları, DNA metilasyon analizleri, in situ hibridizasyon (FISH), floresan, immün ve haberci gen deneyleri gibi alt çeşitli uygulamalar için uygundur.

Giriş

Çiçekli bitkiler embriyo endosperm, ikinci bir gübreleme olay türetilen bir besleyici doku ile çevrilidir. Her ikisi de, embriyo ve endosperm çekirdek katının birkaç hücre tabakası ile çevrilidir. Toplu bu dokuların meyve içinde geliştirmek bir tohum, oluşturur. Böylece doku ve Arabidopsis embriyoların hücre spesifik analizleri güçlü bir şekilde erişilememesi nedeniyle bozulmaktadır. Bununla birlikte, geç-küresel ya da geç aşamalarında embriyo nispeten iyi stereomicroscope altında ince tungsten iğneler kullanarak manuel diseksiyon için uygun, ya da onları ayıklamak için forseps kullanarak tohum hafif baskı uygulayarak vardır. Bu tür teknikler, başarılı bir şekilde transkriptomunun veya mikrodizi hibridizasyon, bisülfit dizileme veya RNA sekansları (örneğin, ^1-3) Epigenom profil analizleri için kullanıldı. Buna karşılık, erken küresel sahneye zigot de embriyoların çalışmalar teknik olarak zor kalır. Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma temsilcisi varsabit tohum bölüm ⁴ veya ince araçlar ⁵ ile tohum içinde tek tek embriyo el çekiminden embriyonik dokuların ya lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak genç embriyolar üzerinde orted transcriptome analizleri. Ancak, LCM ekipman erken aşamalarında yaygın olarak bulunan ve manuel embriyo çıkarma değil zaman kolayca transfer edilemez mükemmel diseksiyonu becerileri tüketen ve gerektiren bir. Genom analizleri ek olarak, in situ gen ifade analizleri de Arabidopsis genç, tam monte edilen embriyoların gerçekleştirmek zordur. Bir dereceye kadar, genç embriyolar tohum hafif basınç ile mikroskop slaytlar yayınlanacak ve (örneğin ^6,7 bakınız) immün tarafından bildirici gen deneylerinden veya protein tespiti için kullanılır. Bu teknik, ancak, bu nedenle kantitatif analizleri engelleyen, yüksek verimli embriyo izolasyon izin vermez.

Bu nedenle, etkin ve hızlı bir protokol geliştirdi, kolay transfer, ve alt çeşitli uygulamalar için uygun kurmak için basit Arabidopsis tohum erken embriyo izolasyonu için. Uygun bir izolasyon tampon plastik bir havan tokmağı kullanılarak bir Eppendorf tüpü içinde genç meyvalarda gelen parçalanmış - temel ilkesi, yavaşça tohum ezmek için. Tohum ekstresi, çok oyuklu slayt damlalar halinde yerleştirilir ve bir ters mikroskop kullanılarak istenen aşamada serbest embriyoların varlığı için taranır. Embriyolar bir cam mikroenjektör veya standart laboratuvar pipet bağlı microcapillary kullanılarak toplanır. Moleküler uygulamalar için, embriyo az hacimde hedef tampon aktarmadan önce yeni izolasyon tampon damla içine tekrarlanan serbest iki kez yıkanır. Sitolojik uygulamaları (muhabiri deneyleri, immün, FISH) için, yıkama adımları atlanabilir.

Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır: (i) sitolojik uygulaması için ~ 45 dakika içinde 25-40 embriyolar üretirmoleküler uygulamaları (yıkama adımları dahil) Dokümanında veya 3-4 saat içinde, (ii) bu özel embriyonik aşamalarında izolasyonu, (iii) (iv), kolayca basit ayarları nedeniyle diğer kişi ve laboratuarlar için devredilemez sağlar , yükseltmeleri için uygun olan temel kurulum için uygun ekipman gerektirir, ve (v) başarıyla bu RNA sıralama ^8, gen-spesifik DNA-metilasyon analizi ^9, muhabiri testleri ⁽¹⁰ ve Raissig ve ark. gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanıldı olarak hazırlık.) ve FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux yayınlanmamış,) bkz. Şekil 5.

Protokol

Bu prosedür, Şekil 1'de gösterilen akış şeması özetlenmiştir. Mikrokapilerler ve etkili kurulum Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir, ve embriyo izolasyon tipik aşamalar, Şekil 4 'de gösterilmiştir.

1. Gereç ve Tampon Hazırlanması

Cam mikrokapilerler 1.1 silikon kaplama

1. Sigmacote (Sigma) ~ 5 ml, 15 ml Falcon tüp mikrokapilerler yerleştirin ve birkaç kez ters çevirin.
2. Çözüm çıkarın, 60 ° C de bir alüminyum folyo ile kılcal içeren Falcon tüp yerleştirin ve 3 saat için onları fırında Oda sıcaklığında saklayın.

1.2 ~ 50-100 mikron çaplı microcapillary ipuçları elde

1. El ile bir Bunsen beki üzerinden veya ticari bir çektirmesi (dikey filament çektirmenin veya mikropipet çektirmenin) kullanarak ya 1 mm çaplı cam kılcal çekin.
2. Bir elmas kullanınuçlu kalem veya istediğiniz açılış oluşturmak için çekti kılcal ucu kesmek için bıçak. , Bir stereo mikroskop altında iyi şeklinde kılcal seçin. Açılış 50-100 mikron (Şekil 2) olması gerekmektedir.

1.3 Slayt hazırlanması

1. 5 dakika boyunca Sigmacote (~ 1 ml / slayt) ile tüm kuyuları kaplayarak temiz slaytlar Siliconize, kaldırın. Alüminyum folyo ile fırında, 3 saat. Oda sıcaklığında saklayın.
2. % 10 SDS, nükleaz içermeyen su içinde 2 x 2 dakika (DEPC GKD ₂ O otoklavlanmış),% 70 etanol içinde 2 dakika,% 100 etanol içinde 2 dakika, 10 dakika süreyle çok iyi bir cam mikroskop lamları yıkayın hava kurulayın. Tüm adımlar otoklavlanmış Coplin kavanoz içinde yapılır. Slaytlar her kullanımı arasında kapsamlı bir temizlik sağlayan birden çok kez yeniden kullanılabilir.
3. Hemen önce embriyo izolasyon yayılmasına ~ 10 0.5 ul mg / ml sığır serum albümin (BSA) her iyi ve hava-kuru tüm yüzey üzerinde bir pipet ile.

1.4 Mikroskop ve kılcal kurulum

1. 10x ve 20x büyütme hedefi ile ters bir mikroskop kullanın. Işık kontrast Optimize (embriyo oldukça şeffaf).
2. Mikroskop yanında kılcal cam tutmak için bir micromanipulator yerleştirin. Kılcal cam bir lastik tüp ile bir mikroenjektör (Şekil 3A) veya düzenli P-200 pipet bağlı (Şekil 3B, bu kurulum ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bakınız).
3. Bir ~ 70 ° 'lik açıyla mikroskop lamı (Şekil 3) üzerinde kılcal yerleştirin ve görüş alanında açılması için konumunu ayarlamak.
4. Hemen önce embriyo izolasyon kadar sürebilir ve bırakın ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) kat kılcal için.

1.5 Tamponlar

Tablo 1, alt uygulamalara bağlı olarak izolasyon ve hedef tampon listeler.

1. ~ Örnek başına 1 ml izolasyon tampon taze önce kullanmak ve buz üzerinde tutmak hazırlayın.
2. Buz (moleküler uygulamaları) ya da bir nemli odasında bir mikroskop lamı (sitolojik uygulamaları) bir 0.5 ml Eppendorf düşük bağlayıcı tüp hedef tampon hazırlayın.

2. Tohum Diseksiyon ve Embriyo Ekstraksiyon

Tohum Geliştirme 2.1 Senkronizasyon

1. Çiçek erkekleştirmek ve diğer çiçeklerle maruz pistils temas kaçınarak onları iklim odasında 2 gün tutmak, sonra onları (örneğin ¹¹⁾ tozlaşmak.
2. Temizlenir tohumların mikroskobik inceleme ile sizin büyüme koşullarında geliştirme aşamasında test edin. 4 DAP küresel vermiştir - büyüme koşullarına tohumları (DAP) tozlaşma sonra 2.5 gün toplanan (21 16 saat ışık ° C, 18 karanlık 8 saat ° C ve% 70 nem) özellikle 2-4 hücreli embriyo ve tohum 3,5 toplanan vermiştir embriyolar.

2.2 Tohum Diseksiyon ve Kopma

1. S çıkarınforseps ve insülin iğneleri ile bir stereo mikroskop altında 10-15 meyvaları (~ 2.5 DAP) den eeds.
2. Buz üzerine yerleştirilir, 2 ml lik yuvarlak dipli Eppendorf tüp içinde 20 ul tampon içinde izolasyon tohum daldırın.
3. Yavaşça çekirdeği özütü bulutlu hale gelene kadar embriyo serbest bırakmak için bir plastik havaneli (DEPC GKD ₂ O ile çalkalandı,% 10 SDS ile önceden temizlenmiş ve% 70 etanol ile yıkanmış) ile tohum kırmaktadır. Uygulamak için kuvvet deneme üzerine her kullanıcı tarafından belirlenecektir.
4. Havaneli yıkayın ve örnek sulandırmak için izolasyon tampon 300 ul ile havan eli durulayın.
5. Spin-aşağı 5 saniye için 5000 xg özü. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetleme pelet özü tekrar süspansiyon.
6. 30 mikron naylon örgü (PartecCelltricks gelen örneğin, tüp adaptörler monte) ile süzülür. Ek bir 200 ul izolasyon tamponu ile örgü durulayın.

3. Embriyo İzolasyon

3.1 Slayt hazırlanması

1. Yeri ters mikroskop sahnede temiz, BSA ile kaplanmış ve silikonlu çok iyi slayt, yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme filtre çekirdeği ekstresi tekrar süspansiyon ve 1 veya 2 kuyulara 40-50 ul çekirdeği ekstresi 2 damlacıkları pipetle . Aynı anda sadece 1 veya 2 damla Eleme örnek buharlaşmasını önler.
2. Daha önce olduğu gibi hazırlanan farklı bir slayt iyi taze izolasyon tampon Sıra 50 ul ^(1. yıkama damla). Buharlaşmasını önlemek için üstü kapalı, nemli odasında bu slayt tutun.

3.2 Ekran, temiz, toplamak

1. 10x büyütme amacı ile istenilen aşamada embriyo için çekirdeği ekstresinin damlacıkları ekran. Gerekirse, 20x büyütme ile sahne onaylayın. Embriyolar genellikle slayt dibine çöker.
2. Manuel bir tungsten iğne, bir insülin iğne veya benzeri ekipman ile embriyo etrafında pislikleri temizleyin.
3. Mikromanipülatör, t kullanarak embriyo yakın kılcal cam taşıyınmümkün olduğu kadar az çözüm olarak ile embriyo kadar AKE.
4. Birkaç embriyolar (örneğin tek bir damlacık) toplamak ve ^1. yıkama damla (moleküler uygulama) veya hedef tamponu (sitolojik uygulamaları) bunları bırakın. Her toplama yuvarlak az hacmi (tüm toplama mermi toplam hacmi <5 ul olmalıdır) toplanmalıdır 5-10 dakika ve embriyoların içinde tutulmalıdır.
5. Embriyoların istenilen miktarda (merkezi, mümkünse, hatırlama kolaylaştırmak için) ^1. yıkama damla toplanan kadar tarama ve tahsilat tekrarlayın.
6. Yıkama damla (enkaz üzerinden yapılmaktadır eğer, hatırlama önce iğne ile bunları kaldırmak) için aynı anda tüm embriyolar hatırlamak.
7. 50 ul bir ^2. yıkama damla içine embriyolar bırakın. 3.2.6 tekrarlayın.
8. Hedef tampon içinde embriyoların bırakın. Transfer kılcal ucu sadece bir kişi değil, daldırma, içermelidir.
9. Microcapil değiştirinBir sonraki örnek ları.

Sonuçlar

Moleküler yıkama uygulamaları için, örneğin, gerçekleştirilmesi durumunda eden embriyo izolasyon prosedürü (Şekil 1), 4 saat içinde 40 embriyo kadar izolasyonu sağlayan ya da bir saatten daha kısa bir süre içinde yıkama, ihmal sitolojik uygulamalar için, örneğin eğer. Gösterir Şekil 2, yüksek ve alçak kalite mikrokılcal uçlarına ve Şekil 3, embriyo izolasyon makinenin bir yapıyı göstermektedir. Şekil 4,...

Tartışmalar

Biz etkili, hızlı bir embriyo izolasyon protokolü geliştirilmiş ve kolayca diğer laboratuarlara transfer edilebilir.

Burada tanımlanan cihaz, bir ters mikroskop, bir mikromanipülatör, cam mikrokapilerler, dikey bir filaman çektirme ve mikroenjektör (Şekil 3A) oluşur. Kurulum transkriptomik analizleri ¹⁷ için tek bir hayvan hücre izolasyonu için tarif edilen yönteme benzerdir. Biz de başarıyla cam mikrokapilerler elle bir alev gerilir (ve bir elm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies