Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

Résumé

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de Arabidopsis thaliana Graines. Embryons jusqu'à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l'ADN, l'expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage In situ Analyses d'hybridation.

Résumé

Chez les plantes à fleurs, l'embryon se développe au sein d'un tissu nourricier - l'endosperme - entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l'isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d'Arabidopsis et l'adhérence de l'embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'isolement efficace des jeunes embryons d'Arabidopsis, produisant jusqu'à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d'isolement d'un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l'intermédiaire d'un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d'un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d'applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l'ARN, des analyses de méthylation de l'ADN, l'hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.

Introduction

L'embryon de plantes à fleurs est entouré par l'albumen, un tissu nutritif dérivé d'un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l'endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l'enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l'intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d'embryons d'Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au microscope stéréoscopique, ou en appliquant une légère pression sur la graine en utilisant une pince pour les extraire. Ces techniques ont été utilisées avec succès pour les analyses de profilage épigénome telles que l'hybridation de puces à ADN, séquençage au bisulfite, ou de l'ARN (par exemple ^1-3) ou transcriptome. En revanche, les études d'embryons au zygote jusqu'au début du stade globulaire restent techniquement difficile. À ce jour, seules quelques études ont repLes analyses du transcriptome signalés auparavant sur ​​les jeunes embryons en utilisant soit microdissection laser-capture (LCM) de tissus embryonnaires de sections de semences fixe ⁴ ou extraction manuelle des embryons individuels de semences à l'intérieur en utilisant des outils fines ^5. Toutefois, l'équipement LCM n'est pas couramment disponibles et extraction de l'embryon aux premiers stades manuel prend du temps et exige d'excellentes compétences de dissection qui ne sont pas facilement transférables. En plus des analyses du génome entier, dans les analyses d'expression génique in situ sont également difficiles à réaliser sur les jeunes, l'ensemble du montage embryons d'Arabidopsis. Dans une certaine mesure, les jeunes embryons peuvent être libérés sur des lames de microscope par une légère pression sur les graines et utilisés pour des essais de gène rapporteur ou la détection des protéines par coloration immunologique (voir par exemple ^6,7). Cette technique, cependant, ne permet pas l'isolement des embryons à haut débit, entravant ainsi les analyses quantitatives.

Par conséquent, nous avons développé un protocole efficace et rapidepour l'isolement précoce de l'embryon à partir de graines d'Arabidopsis qui est simple à mettre en place, facilement transférable et approprié pour une variété d'applications en aval. Le principe de base est d'écraser doucement graines - disséqué de jeunes siliques dans un tube Eppendorf à l'aide d'un pilon en plastique dans un tampon d'isolement approprié. L'extrait de graines est placée sous forme de gouttelettes sur un chariot multi-puits et est projeté pour la présence d'embryons libérés au stade souhaité à l'aide d'un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l'aide d'un verre MICROCAPILLAIRE attaché à un micro-injecteur ou une pipette de laboratoire standard. Pour les applications moléculaires, les embryons sont lavés deux fois par libération répétées dans des gouttes d'un nouveau tampon d'isolement avant de les transférer à la mémoire tampon de destination dans un volume minimal. Pour les applications cytologiques (dosages de rapporteur, immunomarquage, poisson), des étapes de lavage peuvent être omises.

La méthode présente plusieurs avantages: (i) il donne 25-40 embryons ~ 45 min pour app cytologiquecations ou à 3-4 h pour les applications moléculaires (qui comprend les étapes de lavage), (ii) il permet l'isolement des stades embryonnaires spécifiques, (iii) il est facilement transférable à d'autres personnes et les laboratoires en raison de sa configuration simple, (iv) nécessite un équipement abordable pour la configuration de base qui se prête à la mise à niveau et (v) il a été utilisé avec succès pour diverses applications en aval telles que séquençage de l'ARN ^8, analyse méthylation de l'ADN spécifique du gène ^9, des dosages de rapporteur ⁽¹⁰ et Raissig et al., en prép.) et le poisson (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédit, voir figure 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

La procédure est résumée dans l'organigramme de la figure 1. Le microcapillaires et la configuration instrumentale sont présentés dans la figure 2 et la figure 3, et les étapes typiques de l'isolement de l'embryon sont présentés dans la figure 4.

1. Matière et mémoire tampon Préparation

1.1 Silicon revêtement de verre microcapillaires

1. Placez le microcapillaires dans un tube Falcon de 15 ml avec environ 5 ml de Sigmacote (Sigma) et inverser plusieurs fois.
2. Retirez la solution, placer le tube Falcon contenant les capillaires dans une feuille d'aluminium et cuire au four pendant 3 heures à 60 ° C. Stocker à température ambiante.

1.2 Obtenir ~ 50-100 um de diamètre conseils microcapillaires

1. Tirez 1 mm de diamètre capillaires en verre soit manuellement sur un bec Bunsen ou en utilisant un extracteur commercial (extracteur filament vertical ou micropipette extracteur).
2. Utiliser un diamantStylo à pointe ou une lame pour couper le bout du capillaire tiré pour créer l'ouverture souhaitée. Sélectionnez les capillaires meilleure forme sous un microscope stéréo. L'ouverture devrait être 50-100 um (Figure 2).

1.3 Préparation de la lame

1. Siliconize lames propres en couvrant tous les puits avec Sigmacote (~ 1 ml / slide) pendant 5 min, retirer. Cuire 3 heures dans du papier d'aluminium. Stocker à température ambiante.
2. Laver les lames microscopiques verre multi-puits pendant 10 min dans 10% SDS, 2 x 2 min dans de l'eau sans nucléase (autoclave DEPC-DDH ₂ O), 2 min dans de l'éthanol à 70%, 2 min dans de l'éthanol à 100%, air- sécher. Toutes les étapes sont effectuées dans des bocaux Coplin autoclave. Les diapositives peuvent être réutilisés plusieurs fois fournir un nettoyage en profondeur entre chaque utilisation.
3. Juste avant l'embryon propagation d'isolement ~ 0,5 ul de 10 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) avec une pipette sur toute la surface de chaque puits et séché à l'air.

1.4 Microscope et la configuration capillaire

1. Utiliser un microscope inversé avec un 10x et 20x objectif de grossissement. Optimiser le contraste de lumière (embryons sont tout à fait transparent).
2. Placez un micromanipulateur pour maintenir le capillaire en verre à côté du microscope. Le verre capillaire est connecté à un micro-injecteur (figure 3A) ou à une pipette régulière P-200 via un tube en caoutchouc (Figure 3B, voir discussion pour une description détaillée de cette installation).
3. Placer le capillaire au-dessus de la lame de microscope à un angle de ~ 70 ° (figure 3) et régler la position d'avoir l'ouverture dans le champ de vision.
4. Juste avant l'isolement de l'embryon prendre et relâcher ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) pour enrober le capillaire.

1,5 Tampons

Le tableau 1 présente l'isolement et la destination des tampons en fonction des applications en aval.

1. Préparer ~ 1 tampon d'isolement ml par échantillon fraîchement avant l'utilisation et le garder sur la glace.
2. Préparer le tampon de destination dans un tube à faible liaison 0,5 ml Eppendorf sur la glace (applications moléculaires) ou sur une lame de microscope (applications cytologiques) dans une chambre humide.

2. Dissection de semences et d'extraction de l'embryon

2.1 Synchronisation de développement des semences

1. Émasculer fleurs et les garder 2 jours dans la chambre de croissance, tout en évitant le contact des pistils exposés avec d'autres fleurs, alors les polliniser (par exemple ^11).
2. Testez le stade de développement sous vos conditions de croissance par étude microscopique des graines compensés. Grâce à nos conditions de croissance (16 heures de lumière à 21 ° C, 8 h obscurité à 18 ° C et 70% d'humidité) de graines collectées 2,5 jours après la pollinisation (DAP) ont livré principalement 2-4 embryons cellulaires et les graines collectées 3,5 à 4 DAP a donné globulaire embryons.

2.2 Seed Dissection et Rupture

1. Retirez le seeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sous une loupe binoculaire avec des pinces et des aiguilles à insuline.
2. Plonger les graines dans 20 tampon d'isolement ul dans un tube Eppendorf 2 ml à fond rond placé sur la glace.
3. Écraser délicatement les graines avec un pilon en plastique (préalablement nettoyé avec 10% de SDS, rincé avec DEPC-DDH ₂ O et lavé avec de l'éthanol à 70%) pour libérer les embryons jusqu'à ce que l'extrait de pépins est trouble. La force à appliquer doit être déterminé par chaque utilisateur lors de son procès.
4. Rincer le pilon avec 300 pi de tampon d'isolement pour laver le pilon et diluer l'échantillon.
5. Spin-bas l'extrait à 5000 g pendant 5 sec. Resuspendre doucement l'extrait granulés par aspiration-et-vient 2-3 fois.
6. Filtrer l'extrait avec une maille de nylon de 30 um (monté sur les adaptateurs de tubes, par exemple de PartecCelltricks). Rincez le filet avec un tampon d'isolement supplémentaire de 200 ul.

3. Isolation des embryons

3.1 Préparation de la lame

1. Placez une lame multi-puits propre, BSA-couché et siliconé sur la scène du microscope inversé, remettre en suspension l'extrait de graines filtrée par un léger pipetage de haut en bas et d'une pipette 2 gouttes de 40-50 ul extrait de graines dans 1 ou 2 puits . Dépistage seulement 1 ou 2 gouttes à la fois empêche l'évaporation de l'échantillon.
2. Placer 50 pi de tampon d'isolement frais (1 goutte de lavage ^st) dans un puits d'une autre diapositive préparée comme avant. Gardez cette diapositive dans une chambre humide couverte pour éviter l'évaporation.

3.2 Ecran, nettoyer, collecter

1. Écran les gouttelettes d'extrait de pépins pour les embryons au stade souhaité avec l'objectif de grossissement de 10x. Si nécessaire, confirmez la scène avec un grossissement de 20x. Les embryons coulent généralement vers le bas de la glissière.
2. Retirer manuellement les débris autour de l'embryon d'une aiguille de tungstène, d'une aiguille d'insuline ou d'un équipement similaire.
3. Déplacez le capillaire en verre près de l'embryon à l'aide du micromanipulateur, take l'embryon avec aussi peu de solution possible.
4. Rassemblez plusieurs embryons (par exemple tous une gouttelette) et les libérer dans la chute de lavage ^1er (demande moléculaire) ou dans un tampon de destination (applications cytologiques). Chaque tour de collecte doit être conservé dans les 5-10 min et embryons doivent être collectés dans un volume minimal (le volume total de tous les tours de collecte doit être <5 pi).
5. Répéter le dépistage et la collecte jusqu'à la quantité désirée d'embryons est rassemblée dans la chute de lavage ^1er (au centre, si possible, afin de faciliter souvenir).
6. Rappelez tous les embryons à la fois de la baisse de lavage (si des débris sont reportés, retirez-les avec une aiguille avant de souvenir).
7. Relâchez les embryons dans une goutte de lavage ^{2 ème} de 50 pi. Répétez 3.2.6.
8. Relâchez les embryons dans le tampon de destination. Le transfert devrait impliquer seulement un contact, et non l'immersion, de la pointe capillaire.
9. Remplacez le microcapilLary pour l'échantillon suivant.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Notre procédure d'isolement de l'embryon (figure 1) permet d'isoler jusqu'à 40 embryons à 4 heures si les lavages sont effectués, par exemple pour les applications moléculaires, ou en moins d'une heure si lavages sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. Figure 2 affiche haut et bas Conseils microcapillaires qualité et la figure 3 montre la configuration de la machine d'isolement de l'embryon. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Nous avons élaboré un protocole d'isolement de l'embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d'autres laboratoires.

L'équipement décrit ici se compose d'un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l'isolement de cellules animales unique pour l'analyse transcript...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies