Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

Resumo

Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento de Arabidopsis thaliana Sementes. Até 40 embriões podem ser isolados em 1 hora a 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. O procedimento é adequado para transcriptoma, a metilação do DNA, a expressão do gene repórter, imunomarcação e fluorescência In situ Análises de hibridização.

Resumo

Em plantas com flores, o embrião se desenvolve dentro de um tecido nutritivo - o endosperma - cercado pelos tegumentos de sementes maternas (ou tegumento). Como consequência, o isolamento de embriões de plantas em fases iniciais (1 célula para a fase globular) é tecnicamente difícil devido à sua relativa inacessibilidade. Dissecção Manual eficiente em fases iniciais é fortemente prejudicada devido ao pequeno tamanho dos jovens de sementes de Arabidopsis e a adesividade do embrião para os tecidos circundantes. Aqui, nós descrevemos um método que permite o isolamento eficiente de embriões jovens de Arabidopsis, originando até 40 embriões em 1 hora e 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. Os embriões são libertados no tampão de isolamento por esmagamento ligeiramente 250-750 sementes com um pilão de plástico num tubo Eppendorf. Um copo microcapilar ligado a qualquer uma pipeta padrão de laboratório (através de um tubo de borracha) ou de um microinjetor controlada hidraulicamente é usado para coletar embriões de lugar gotículasd numa lâmina de multi-poços em um microscópio óptico invertido. As competências técnicas necessárias são simples e facilmente transferível, ea configuração básica não requer equipamento caro. Os embriões recolhidos são apropriados para uma variedade de aplicações a jusante, tais como RT-PCR, o RNA de sequenciação, análise de metilação de ADN, hibridação in situ fluorescente (FISH), a imunocoloração, e ensaios de gene repórter.

Introdução

O embrião de plantas floridas está rodeado pelo endosperma, um tecido nutritivo derivado de um segundo evento de fertilização. Ambos embrião e endosperma está cercado por várias camadas de células do tegumento. Colectivamente estes tecidos formar uma semente, que se desenvolvem no interior do fruto. Assim, tecidos e análises específicas de células de embriões de Arabidopsis são fortemente prejudicada devido a sua inacessibilidade. No entanto, os embriões nas fases de fim de globulares ou mais tarde, são relativamente bem passível de dissecção manual utilizando agulhas finas de tungstênio sob o microscópio estereoscópico, ou com uma ligeira pressão sobre a semente, usando uma pinça para extraí-los. Tais técnicas foram utilizadas com sucesso para transcriptoma ou análises de perfis epigenoma como hibridização microarray, sequenciamento bissulfito, ou RNA seqüência (por exemplo, ^1-3). Em contraste, os estudos de embriões no zigoto até a fase globular cedo permanecem tecnicamente desafiador. Até o momento, poucos estudos têm repanálises de transcriptoma orted sobre jovens embriões usando tanto microdissection de captura a laser (LCM) de tecidos embrionários de sementes seções fixas ^quatro ou extração manual dos embriões individuais a partir de sementes, utilizando ferramentas finas ^5. No entanto, o equipamento GCV não é vulgarmente disponíveis e extracção manual do embrião em fases iniciais é demorado e que exige excelentes capacidades de dissecação que não são facilmente transferíveis. Em adição à análise de todo o genoma, em análises de expressão de genes in situ também são difíceis de executar em jovens, conjunto de montagem em embriões de Arabidopsis. Em certa medida, os embriões jovens pode ser libertado em lâminas de microscópio por uma suave pressão sobre as sementes e utilizada para os ensaios de gene repórter ou de detecção de proteínas por coloração imunológica (por exemplo, ver ^6,7). Esta técnica, no entanto, não permitir o isolamento de embriões de alto rendimento, impedindo assim as análises quantitativas.

Por isso, desenvolvemos um protocolo eficiente e rápidapara o isolamento de embrião a partir de sementes de Arabidopsis que é simples de configurar, facilmente transferíveis, e apropriado para uma variedade de aplicações a jusante. O princípio básico consiste em triturar suavemente sementes - dissecada jovens siliques em um tubo Eppendorf utilizando um pilão de plástico num tampão de isolamento adequado. O extracto de semente é colocada em gotas sobre uma lâmina de multi-poços e é pesquisado quanto à presença de embriões libertados na fase desejada usando um microscópio invertido. Os embriões são coletados por meio de um vidro microcapilar ligado a um microinjetor ou uma pipeta de laboratório padrão. Para aplicações moleculares, os embriões são lavados duas vezes por libertação repetida em gotas de novo tampão de isolamento antes de transferi-los para o buffer de destino num volume mínimo. Para aplicações citológicos (ensaios repórter, positividade, peixe), as etapas de lavagem pode ser omitido.

O método oferece várias vantagens: (i) produz 25-40 embriões em ~ 45 min para aplicação citológicocações ou em 3-4 hr para aplicações moleculares (incluindo as etapas de lavagem), (ii) que permite o isolamento de estágios embrionários específicas, (iii) é facilmente transferível para outras pessoas e laboratórios, devido à sua configuração simples, (iv) requer equipamento acessível para a configuração básica, que é passível de upgrades, e (v) foi usado com sucesso por várias aplicações a jusante, como RNA seqüenciamento ^8, a análise de DNA-metilação-específica gene ^9, ensaios repórter ⁽¹⁰ e Raissig et al., em prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédito, ver Figura 5).

Protocolo

O procedimento está resumido no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. O microcapilares e a configuração instrumentais são apresentados na Figura 2 e Figura 3, e os passos típicos de isolamento de embriões são mostrados na Figura 4.

1. Material e Preparação de buffer

1,1 Silício revestimento de vidro microcapilares

1. Coloque a microcapilares em um tubo Falcon de 15 ml com ~ 5 ml de Sigmacote (Sigma) e gire várias vezes.
2. Remover a solução, colocar um tubo Falcon contendo os capilares numa folha de alumínio e cozer durante 3 horas a 60 ° C. Guarde à temperatura ambiente.

1.2 Obter ~ 50-100 micrometros de diâmetro dicas microcapilares

1. Puxe um milímetro de diâmetro capilares de vidro manualmente ao longo de um bico de Bunsen ou usando um extrator comercial (vertical puxador de filamento ou micropipeta extrator).
2. Use um diamantecaneta de ponta ou lâmina para cortar a extremidade do capilar puxado para criar a abertura desejada. Selecione a melhor forma de capilares sob um microscópio estéreo. A abertura deve ser de 50-100 mM (Figura 2).

1.3 Preparação da lâmina

1. Siliconize lâminas limpas, cobrindo todos os poços com Sigmacote (~ 1 ml / lâmina), durante 5 minutos, remover. Asse 3 hr em papel alumínio. Guarde à temperatura ambiente.
2. Lavar os múltiplos poços lâminas microscópicas de vidro durante 10 min em SDS a 10%, 2 x 2 minutos em água livre de nuclease (autoclavado DEPC _ddH2O), 2 min em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 100%, com ar- secar. Todas as etapas são feitas em frascos autoclavados Coplin. As lâminas podem ser reutilizados várias vezes proporcionando limpeza completa entre cada uso.
3. Pouco antes do isolamento propagação embrião ~ 0,5 l de 10 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA), com uma pipeta ao longo de toda a superfície de cada poço e ar seco.

1.4 Microscópio e configuração capilar

1. Use um microscópio invertido com uma objetiva de 20x e 10x. Otimizar o contraste de luz (embriões são bastante transparente).
2. Coloque um micromanipulador para segurar o capilar de vidro, ao lado do microscópio. O capilar de vidro, está ligado a um microinjector (Figura 3A) ou para um P-200 pipeta regularmente através de um tubo de borracha (Figura 3B, ver a discussão para uma descrição detalhada desta configuração).
3. Colocar o tubo capilar acima da lâmina de microscópio com um ângulo de ~ 70 ° (figura 3) e ajustar a posição de ter a abertura no campo de visão.
4. Pouco antes do isolamento do embrião tomar-se e libertar ~ 5-10 ul de BSA (1 mg / ml) para revestir o capilar.

1,5 Buffers

A Tabela 1 lista os buffers de isolamento e de destino, dependendo das aplicações a jusante.

1. Prepare ~ 1 ml de tampão de isolamento por amostra imediatamente antes da utilização e mantenha-o no gelo.
2. Prepare o buffer de destino em um ml tubo de baixa ligação 0,5 Eppendorf no gelo (aplicações moleculares) ou em uma lâmina de microscópio (aplicações citológicas) em uma câmara úmida.

2. Dissecção sementes e extração de embriões

2.1 Sincronização de desenvolvimento da semente

1. Emasculate flores e mantê-los 2 dias em câmara de crescimento, evitando o contacto dos pistilos expostas com outras flores, então polinizar deles (por exemplo, ^11).
2. Teste o estágio de desenvolvimento em suas condições de crescimento por meio de investigação microscópica de sementes limpas. Com as nossas condições de crescimento (16 horas de luz a 21 ° C, 8 horas escuro, a 18 ° C e 70% de humidade), as sementes recolhidas 2,5 dias após a polinização (DAP) rendeu principalmente 2-4 embriões de células e as sementes colhidas 3,5-4 DAP rendeu globular embriões.

2.2 Dissecção de Sementes e Rupture

1. Remover a sEEDS 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sob um microscópio estereoscópico com uma pinça e agulhas de insulina.
2. Mergulhar as sementes em 20 ul de tampão de isolamento, em 2 ml de um tubo de fundo redondo de Eppendorf colocada em gelo.
3. Suavemente esmagar as sementes com um pilão de plástico (pré-lavado com 10% de SDS, enxaguado com DEPC _ddH2O e lavou-se com etanol a 70%) para libertar os embriões até o extracto de semente é turvo. A força a aplicar é determinada pelo utilizador, a cada ensaio.
4. Lavar o almofariz com 300 ul de tampão de isolamento para lavar o pilão e diluir a amostra.
5. Spin-se o extrato a 5.000 xg por 5 seg. Delicadamente ressuspender o extrato sedimentados por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes.
6. Filtrar o extracto com uma malha de nylon de 30 um (montado em adaptadores de tubos, por exemplo, a partir de PartecCelltricks). Lavar a malha com um tampão de isolamento adicional de 200 ul.

3. Isolamento embrião

3.1 Preparação da lâmina

1. Coloque um pano limpo, multi-slides bem BSA-revestido e siliconizada no palco do microscópio invertido, ressuspender o extrato de semente de filtrada com cuidado pipetando cima e para baixo e pipetar 2 gotas de extrato de semente de 40-50 mL em um ou dois poços . Screening apenas 1 ou 2 gotas de cada vez evita a evaporação da amostra.
2. Transferem-se 50 ul de tampão de isolamento fresco (1 gota de lavagem ^r) num poço de uma lâmina diferente preparada como antes. Manter este slide em uma coberta, câmara úmida para evitar a evaporação.

3.2 tela, limpar, recolher

1. Tela de gotas de extrato de semente de embriões no estágio desejado com o objetivo de ampliação de 10x. Se necessário, confirmar o palco com a ampliação de 20x. Os embriões geralmente descem para o fundo do slide.
2. Remover manualmente os restos em torno do embrião com uma agulha de tungstênio, uma agulha de insulina ou equipamento similar.
3. Mover o vidro capilar próximo do embrião utilizando o micromanipulador, take-se o embrião com tão pouco quanto possível solução.
4. Colete vários embriões (por exemplo, todos uma gota) e liberá-los no gota de lavagem 1 ^º (aplicação molecular) ou no buffer de destino (aplicações citológicos). Cada rodada coleta deve ser mantido dentro de 5-10 min e embriões devem ser coletadas em um volume mínimo (o volume total de todas as rodadas de coleta deve ser <5 mL).
5. Repita a triagem e recolha até a quantidade desejada de embriões é recolhida no ^r gota uma lavagem (centralmente, se possível, para facilitar a recordação).
6. Recordar todos os embriões de uma só vez a partir da queda de lavagem (se os restos são transportados, retire-os com uma agulha antes de recordação).
7. Solte os embriões em uma gota de lavagem 2 ^º de 50 l. Repita 3.2.6.
8. Solte os embriões no buffer de destino. A transferência deve envolver apenas um contato, e não de imersão, da ponta do capilar.
9. Substitua o microcapilLary para a próxima amostra.

Resultados

O processo de isolamento do embrião (Figura 1) permite o isolamento de até 40 embriões em 4 horas, se as lavagens são realizadas, por exemplo, para aplicações moleculares, ou em menos de uma hora, se as lavagens são omitidos, por exemplo, para aplicações citológicos. Figura 2 exibe alta e baixa dicas microcapilares qualidade e A Figura 3 mostra a configuração da máquina de isolamento do embrião. Figura 4 mostra o processo...

Discussão

Foi desenvolvido um protocolo de isolamento do embrião, que é rápida, eficaz, e pode ser facilmente transferido para outros laboratórios.

O equipamento aqui descrito é composto por um microscópio invertido, um micromanipulador, vidro microcapilares, um puxador de filamento vertical e um microinjector (Figura 3A). A instalação é semelhante à descrita para o isolamento única célula animal para análises transcriptomics ^17. Também trabalhou com sucesso c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies