Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

Riepilogo

Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo da Arabidopsis thaliana Semi. Fino a 40 embrioni possono essere isolati in 1 ora a 4 ore, a seconda dell'applicazione a valle. La procedura è adatta per transcriptome, metilazione del DNA, l'espressione del gene reporter, immunostaining e fluorescenza In situ Analisi di ibridazione.

Abstract

In piante da fiore, l'embrione si sviluppa all'interno di un tessuto nutriente - l'endosperma - circondato dai tegumenti seminali materni (o tegumento). Come conseguenza, l'isolamento di embrioni vegetali nelle fasi (1 cellula per stadio globulare) è tecnicamente difficile a causa della loro relativa inaccessibilità. Efficiente dissezione manuale a stadi precoci è fortemente compromessa dalla piccola dimensione di giovani semi di Arabidopsis e l'adesività dell'embrione ai tessuti circostanti. Qui, descriviamo un metodo che permette l'isolamento efficiente di giovani embrioni di Arabidopsis, cedendo fino a 40 embrioni in 1 ora a 4 ore, a seconda dell'applicazione a valle. Gli embrioni vengono rilasciati nel buffer di isolamento di poco schiacciamento 250-750 semi con un pestello di plastica in una provetta Eppendorf. Un bicchiere microcapillare collegato a entrambi una pipetta di laboratorio standard (tramite un tubo di gomma) o di un microinjector comando idraulico viene utilizzato per raccogliere gli embrioni da luogo gocciolined su una diapositiva multi-pozzetto su un microscopio a luce invertita. Le competenze tecniche richieste sono semplici e facilmente trasferibili, e l'impostazione di base non richiede attrezzature costose. Gli embrioni raccolti sono adatti per una varietà di applicazioni a valle, come la RT-PCR, l'RNA sequenziamento, analisi di metilazione del DNA, ibridazione in situ fluorescente (FISH), immunoistochimica, e saggi di geni reporter.

Introduzione

L'embrione di piante da fiore è circondato dal endosperma, un tessuto nutritivo derivato da un secondo evento fecondazione. Sia dell'embrione e dell'endosperma sono circondati da diversi strati di cellule del tegumento. Collettivamente questi tessuti formano un seme, che si sviluppano all'interno del frutto. Così, tessuti e cellule specifiche analisi di embrioni di Arabidopsis sono fortemente compromesse a causa della loro inaccessibilità. Ciò nonostante, gli embrioni nelle fasi tardo-globulari o poi sono relativamente ben suscettibili di dissezione manuale utilizzando aghi sottili di tungsteno con lo stereomicroscopio, o applicando una leggera pressione sul seme con pinze per estrarre loro. Tali tecniche sono state utilizzate con successo per l'analisi del trascrittoma o profilazione epigenoma come ibridazione di microarray, sequenziamento bisolfito, o RNA sequenza (ad esempio ^1-3). Al contrario, gli studi di embrioni allo stadio di zigote globulare precoce restano tecnicamente impegnativo. Ad oggi, solo pochi studi hanno reported analisi trascrittoma sui giovani embrioni utilizzando sia microdissezione laser-capture (LCM) di tessuti embrionali di sezioni semi fissi ⁴ o estrazione manuale di singoli embrioni da dentro i semi utilizzando strumenti raffinati ^5. Tuttavia, attrezzature LCM non è comunemente disponibile e l'estrazione manuale embrione nelle fasi iniziali in termini di tempo e che richiedono ottime capacità di dissezione che non sono facilmente trasferibili. Oltre alle analisi genome-wide, analisi in situ di espressione genica sono anche difficili da eseguire sui giovani, tutto il montaggio embrioni di Arabidopsis. In una certa misura, i giovani embrioni possono essere rilasciati su vetrini da microscopio con una leggera pressione sui semi e utilizzati per i saggi reporter gene o il rilevamento di proteine ​​di immunoistochimica (per esempio vedi ^6,7). Questa tecnica, tuttavia, non consente l'isolamento embrione ad alta produttività, ostacolando analisi quantitative.

Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente e rapidaper l'isolamento embrione precoce dai semi di Arabidopsis che è semplice da installare, facilmente trasferibile, e adatto per una varietà di applicazioni a valle. Il principio di base è quello di schiacciare delicatamente i semi - sezionato da giovani silique in una provetta Eppendorf con un pestello di plastica in un buffer di isolamento adeguato. L'estratto di semi viene posto in goccioline in una diapositiva multi-pozzetto ed esaminato per la presenza di embrioni rilasciate nella fase desiderata utilizzando un microscopio invertito. Gli embrioni sono raccolti utilizzando un bicchiere microcapillare attaccato ad un microinjector o una pipetta di laboratorio standard. Per applicazioni molecolari, gli embrioni vengono lavati due volte mediante ripetute rilascio in gocce di nuovo buffer isolamento prima di trasferirli al buffer di destinazione in un volume minimo. Per le applicazioni citologici (saggi di giornalista, immunoistochimica, FISH), fasi di lavaggio possono essere omessi.

Il metodo offre numerosi vantaggi: (i) cede 25-40 embrioni in ~ 45 min per app citologicacazioni o in 3-4 hr per applicazioni molecolari (comprese le fasi di lavaggio), (ii) permette l'isolamento degli stadi embrionali specifici, (iii) è facilmente trasferibile ad altre persone e laboratori grazie alla sua semplice configurazione, (iv) richiede attrezzature conveniente per la configurazione di base che è suscettibile di aggiornamenti, e (v) è stato utilizzato con successo per varie applicazioni a valle come RNA sequenziamento ^8, gene-specifico DNA-metilazione analisi ^9, saggi Reporter ⁽¹⁰ e Raissig et al., in prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inedito, vedi figura 5).

Protocollo

La procedura è riassunto nel diagramma di flusso mostrato in Figura 1. Il microcapillari e il setup strumentale sono mostrati in Figura 2 e Figura 3, e fasi tipiche di isolamento embrioni sono mostrati in Figura 4.

1. Materiale e Buffer Preparazione

1.1 Silicon rivestimento di vetro microcapillari

1. Collocare il microcapillari in una provetta Falcon 15 con ~ 5 ml di Sigmacote (Sigma) e capovolgere varie volte.
2. Rimuovere la soluzione, porre la provetta Falcon contenente i capillari in un foglio di alluminio e cuocere per 3 ore a 60 ° C. Conservare a temperatura ambiente.

1.2 Ottenere ~ 50-100 micron di diametro punte microcapillare

1. Pull 1 millimetro di diametro in vetro capillari sia manualmente su un becco Bunsen o utilizzando un estrattore commerciale (verticale filamento estrattore o micropipetta estrattore).
2. Utilizzare un diamante-punta penna o la lama per tagliare la punta del capillare tirato per creare l'apertura desiderata. Selezionare la migliore forma di capillari in un microscopio stereo. L'apertura dovrebbe essere 50-100 micron (Figura 2).

1.3 Preparazione del vetrino

1. Siliconize vetrini puliti coprendo tutti i pozzetti con Sigmacote (~ 1 ml / slide) per 5 minuti, togliere. Cuocere 3 ore in un foglio di alluminio. Conservare a temperatura ambiente.
2. Lavare i multi-pozzetto di vetro preparati microscopici per 10 min a 10% SDS, 2 x 2 min in acqua priva di nucleasi (autoclave DEPC-DDH ₂ O), 2 min in etanolo al 70%, 2 min a 100% di etanolo, aria asciugare. Tutti i passaggi sono fatti in autoclave vasetti Vaschette. Le diapositive possono essere riutilizzati più volte fornendo un'accurata pulizia tra ogni utilizzo.
3. Appena prima di embrione isolamento diffusione ~ 0,5 ml di 10 mg / ml di sieroalbumina bovina (BSA) con una pipetta su tutta la superficie di ogni pozzetto e asciugare.

1.4 Microscopio e configurazione capillare

1. Utilizzare un microscopio invertito con un 10x e 20x ingrandimento obiettivo. Ottimizzare il contrasto luce (gli embrioni sono abbastanza trasparenti).
2. Posizionare un micromanipolatore per tenere il capillare di vetro accanto al microscopio. Il capillare di vetro è collegato ad un microinjector (Figura 3A) o ad un normale P-200 pipetta attraverso un tubo di gomma (Figura 3B, vedere discussione per una descrizione dettagliata di questa configurazione).
3. Posizionare il capillare sopra il vetrino con un angolo di ~ 70 ° (figura 3) e regolare la posizione di avere l'apertura nel campo di vista.
4. Appena prima dell'isolamento embrione prendere e rilasciare ~ 5-10 microlitri BSA (1 mg / ml) per rivestire il capillare.

1.5 Buffer

La tabella 1 riporta l'isolamento e la destinazione buffer a seconda delle applicazioni a valle.

1. Preparare ~ 1 ml di tampone di isolamento per campione al momento dell'uso e tenerlo in ghiaccio.
2. Preparare il buffer di destinazione in una provetta Eppendorf ml basso legame 0,5 su ghiaccio (applicazioni molecolari) o su un vetrino da microscopio (applicazioni citologici) in una camera umida.

2. Seed Dissection e Embryo Estrazione

2.1 Sincronizzazione di sviluppo del seme

1. Evirare fiori e tenerli 2 giorni in camera di crescita, evitando il contatto dei pistilli vista con altri fiori, poi li (ad esempio ¹¹⁾ impollinare.
2. Provare la fase di sviluppo sotto le condizioni di crescita da parte di indagine microscopica di semi liquidati. Con le nostre condizioni di crescita (16 ore luce a 21 ° C, 8 ore al buio a 18 ° C e 70% di umidità) semi raccolti 2,5 giorni dopo l'impollinazione (DAP) ha prodotto principalmente 2-4 embrioni di cellule e semi raccolti 3,5-4 DAP prodotto globulare embrioni.

2.2 Seed Dissection e rottura

1. Rimuovere il seeds 10-15 silique (~ 2,5 DAP) sotto uno stereomicroscopio con una pinza e aghi di insulina.
2. Immergere i semi in 20 microlitri di buffer di isolamento in una provetta Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo posto sul ghiaccio.
3. Schiacciare delicatamente i semi con un pestello in plastica (pre-puliti con il 10% SDS, sciacquati con DEPC-DDH ₂ O e lavato con etanolo al 70%) per liberare gli embrioni fino a quando l'estratto di semi è nuvoloso. La forza da applicare è determinato da ogni utente al momento di prova.
4. Lavare pestello con 300 ml di buffer di isolamento per lavare il pestello e diluire il campione.
5. Spin-down l'estratto a 5.000 xg per 5 sec. Risospendere delicatamente l'estratto pellet pipettando su e giù 2-3 volte.
6. Filtrare l'estratto con una rete di nylon 30 micron (montati su adattatori di tubo, ad esempio da PartecCelltricks). Sciacquare la maglia con un buffer di isolamento supplementare di 200 microlitri.

3. Embrione di isolamento

3.1 Preparazione del vetrino

1. Inserire una pulita, BSA-rivestito e siliconato slitta multi-bene sul palco del microscopio invertito, risospendere l'estratto di semi filtrato pipettando delicatamente su e giù e pipettare 2 gocce di estratto di semi di 40-50 ml in 1 o 2 vasche . Vagliatura solo 1 o 2 gocce alla volta impedisce l'evaporazione del campione.
2. Luogo 50 ml di tampone di isolamento fresco (1 ^° goccia lavaggio) in un pozzo di una diapositiva diversa preparato come prima. Mantenere questa diapositiva in una coperta, camera umida per evitare l'evaporazione.

3.2 schermo, pulire, raccogliere

1. Schermare le gocce di estratto di semi di embrioni allo stadio desiderato con l'obiettivo di ingrandimento di 10x. Se necessario, confermare il palco con l'ingrandimento 20x. Gli embrioni di solito si depositano sul fondo della diapositiva.
2. Rimuovere manualmente i detriti intorno all'embrione con un ago di tungsteno, un ago da insulina o apparecchiature simili.
3. Spostare il capillare di vetro vicino l'embrione con il micromanipolatore, take l'embrione con il minimo soluzione possibile.
4. Raccogliere diversi embrioni (p.es. tutti un'unica goccia) e rilasciarli in 1 ^st goccia del lavaggio (applicazione molecolare) o in buffer di destinazione (applicazioni citologici). Ogni round di raccolta deve essere mantenuta entro 5-10 min e gli embrioni devono essere raccolti in un volume minimo (il volume totale di tutti i giri di raccolta deve essere <5 ml).
5. Ripetere lo screening e raccolta fino alla quantità desiderata di embrioni viene raccolto in 1 ^° goccia il lavaggio (centralmente, se possibile, per facilitare il raccoglimento).
6. Ricordare tutti gli embrioni in una volta dalla caduta di lavaggio (se i detriti sono riportati, rimuoverli con un ago prima di raccoglimento).
7. Rilasciare gli embrioni in una goccia di lavaggio 2 ^° di 50 microlitri. Ripetere 3.2.6.
8. Rilasciare gli embrioni nel buffer di destinazione. Il trasferimento dovrebbe coinvolgere solo un contatto, e non ad immersione, della punta capillare.
9. Sostituire il microcapilLary per il campione successivo.

Risultati

Nostra procedura di isolamento embrione (Figura 1) consente l'isolamento di fino a 40 embrioni in 4 ore se lavaggi vengono eseguiti, ad esempio per applicazioni molecolari, o in meno di un'ora se lavaggi sono omessi, ad esempio per applicazioni citologici. Figura 2 visualizza alta e bassa punte microcapillari qualità e la Figura 3 mostra la configurazione della macchina isolamento embrione. Figura 4 mostra il processo di isola...

Discussione

Abbiamo sviluppato un protocollo di isolamento embrione che è rapido, efficace, e possono essere facilmente trasferiti ad altri laboratori.

L'apparecchiatura descritta qui consiste di un microscopio invertito, un micromanipolatore, vetro microcapillari, un estrattore verticale filamento e un microinjector (Figura 3A). La configurazione è simile a quella descritta per l'isolamento singola cellula animale per transcrittomica analisi ^17. Abbiamo anche lavor...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies