高效，快速的早期胚胎分离<em&gt;拟南芥</em&gt;种子

摘要

我们报告了一种简单有效的方法分离胚胎在早期发展阶段拟南芥种子。多达40个胚胎可以在1小时至4小时，分离根据下游应用。该程序是适用于转录，DNA甲基化，报告基因的表达，免疫荧光杂交分析。

摘要

开花植物，胚胎发育滋补组织 - 胚乳 - 经产妇种子珠被包围（或种子大衣）。其结果是，隔离植物胚胎早期阶段（1细胞球形期）在技术上具有挑战性，由于它们的相对位置偏远。在早期阶段高效的手动剥离强烈影响年轻的拟南芥种子的小尺寸和对周围组织的密合性的胚胎。在这里，我们描述了一种方法，使拟南芥幼胚的高效分离，得到在1小时至4小时，根据下游应用的40个胚胎。通过略微粉碎250-750种子用塑料杵在Eppendorf管中，的胚胎被释放到隔离缓冲器。一种玻璃微毛细管连接到一个标准实验室吸液管（通过橡胶管）或液压控制的微量注射器是用来收集胚胎从液滴位上多井倒置显微镜上滑动。所需的技术很简单，很容易转移，并基本安装不需要昂贵的设备。收集胚胎适合用于各种下游应用如逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），RNA测序，DNA甲基化分析， 荧光原位杂交（FISH），免疫荧光，和报告基因检测。

引言

开花植物的胚胎被包围的胚乳，营养组织来自第二施肥事件。胚和胚乳种皮包围几层细胞。总的来说，这些组织形成了一个种子，这里面的水果开发。因此，组织和细胞特异性分析拟南芥胚胎强烈受损，由于他们无法进入。然而，胚胎后期球状或更高的阶段是相对适合人工清扫使用细钨针，体视显微镜下，或使用镊子提取它们施加轻微压力种子。这种技术已成功用于转录或表观基因组的分析，如分析芯片杂交，亚硫酸氢盐测序，RNA测序（ 如 ^1-3）。相反，研究胚胎在球状早期受精卵保持技术上的挑战。至目前为止，只有少数的研究有代表转录组分析orted固定的种子第⁴或个人从种子的胚胎，用细的工具⁵手动提取的胚胎组织可以使用激光捕获显微切割（LCM）的幼胚。然而，LCM设备是不常用的和手动提取胚胎在早期阶段是耗费时间和需要优秀的清扫技能是不会轻易转让。除的全基因组分析， 原位基因表达分析也难以进行，年轻，整个安装拟南芥胚胎。在一定程度上被释放幼胚在种子上的温和的压力来在显微镜玻片上，并用于报告基因检测或蛋白的检测通过免疫组化（例如见^6,7）。然而，该技术中，不允许高通量胚胎隔离，从而阻碍了定量分析。

因此，我们开发了一个高效，快速的协议从拟南芥种子，设置简单，很容易转移，适合各种下游应用的早期胚胎隔离。其基本原理是轻轻压碎种子 - 从解剖幼荚Eppendorf管中，使用塑料杵在适当的隔离缓冲区。籽提取物被放置在液滴上的多井滑动的存在下释放的胚胎进行筛选使用倒置显微镜在所需的阶段。用玻璃微毛细管连接到微量注射器或标准实验室吸液管收集胚胎。对于分子的应用，胚胎洗涤两次，反复滴释放到新的隔离缓冲，然后将他们转移到目标缓冲区在一个最小的体积。进行细胞学的应用程序（报告基因分析，免疫染色，FISH），洗涤步骤可以省略。

该方法有几个优点：（一）〜45分钟进行细胞学的应用程序产生25-40个胚胎的lications或在3-4小时的分子的应用程序（包括清洗步骤），（ii）其允许隔离特异性胚胎阶段，（ⅲ）是很容易转移到其他人的实验室由于其简单的设置，（ⅳ）需要可负担得起的设备的基本设置，这是可以升级，以及（v）被成功地用于各种下游应用，如RNA测序，基因特异性的DNA甲基化分析^9，报告基因分析^（10和Raissig 等。准备），鱼（J.詹尼士，U. Grossniklaus，C. Baroux未发表的，请参阅图5）。

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研究方案

概述图1中所示的流程图中的程序。微毛细管和仪器的设置示于图2和图3，和胚胎隔离的典型步骤示于图4。

1。材料和缓冲液制备

1.1硅涂层玻璃微毛细管

1. 将微毛细管〜5毫升的Sigmacote（Sigma公司）在一个15毫升的Falcon管中，颠倒几次。
2. 移除该溶液中，放置在Falcon管中的毛细血管的铝箔和烘烤3小时，在60℃下在室温下保存。

1.2获取〜50-100微米直径的微细提示

1. 可以手动地在本生灯或通过使用市售的拉出器（垂直丝拔出器或微量拉马），拉直径为1毫米的玻璃毛细管。
2. 使用钻石尖笔或刀片切割的前端的上拉毛细管以创建所需的开口。选择最佳形立体显微镜下毛细血管。的开口应为50-100微米（ 图2）。

1.3玻片制备

1. 硅化干净的幻灯片，涵盖了所有井与Sigmacote（〜1毫升/幻灯片）5分钟，取出。烘烤3小时铝箔。在室温下保存。
2. 洗10分钟，在10％的SDS，2×2分钟在无核酸酶的水（高压灭菌DEPC-DDH ₂ O的），在70％乙醇2分钟，2分钟，在100％乙醇，多井的玻璃显微镜载玻片空气干燥。所有步骤都做了蒸压科普林氏罐子。幻灯片可以重新使用多次，每次使用之间提供彻底的清洁。
3. 之前，为了胚胎隔离扩散〜0.5微升10毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）与吸移管的整个表面上的各孔中，风干。

1.4显微镜和毛细血管设置，

<醇>

使用倒置显微镜，10倍和20倍的放大倍率目标。优化光的对比度（胚胎是相当透明的）。

放置一个显微持有旁边的显微镜的玻璃毛细管。玻璃毛细管连接到微量注射器（ 图3A）或一个普通P-200的移液管，通过橡胶管（ 图3B，请参阅2001的详细说明，在此设置中）。

将毛细管在〜70°的角度（ 图3）以上的显微镜载片上，并调整位置的视场中的开口。

只要胚胎隔离前占用和释放〜5-10微升BSA（1毫克/毫升），涂层的毛细管。

1.5缓冲器

表1列出了根据下游应用的隔离和目标缓冲区。

1. 准备〜1毫升缓冲隔离每个样品在使用前新鲜，并保持它在冰上。
2. 准备目标缓冲区在0.5毫升的Eppendorf低约束力的管冰（分子），或在潮湿室在显微镜幻灯片（细胞学）。

2。种子解剖和胚胎提取

2.1种子发展同步

1. 阉割鲜花和保持他们2天的生长室，同时避免接触的暴露与其他花的雌蕊，然后授粉（ 例如 ^11）。
2. 清除种子的微观调查，在你的成长条件下测试的发展阶段。随着我们的成长条件（16小时光照在21°C，8小时黑暗在18°C和70％的湿度）收集种子2.5天授粉后（DAP）的产生主要有2-4个细胞的胚胎和种子收集了350 - 4 DAP产生球状胚胎。

2.2种子解剖和破裂

1. 删除的s10-15角果立体显微镜下用镊子和胰岛素针（〜2.5 DAP）的电火工品。
2. 种子浸入在20μl的隔离缓冲液在2 ml圆底的Eppendorf管中，在冰上放置。
3. 轻轻粉碎的种子用塑料杵（预清洗的10％的SDS，DEPC-DDH ₂ O的漂洗，并用70％乙醇洗涤）籽提取物是混浊的胚胎，直到释放。武力申请将由审判后，每一个用户。
4. 冲洗洗杵杵用300微升的隔离缓冲和稀释样品。
5. 分拆下来的提取物在5000 XG 5秒。轻轻悬浮颗粒的提取物通过吹打向上和向下的2-3倍。
6. 提取过滤30微米尼龙网（安装管适配器， 例如从PartecCelltricks）。冲洗网带一个额外的200微升隔离缓冲区。

3。胚胎隔离

3.1玻片制备

1. 将一个干净，BSA的涂层和硅多井幻灯片倒置显微镜的舞台上，通过向上和向下轻轻吹打悬浮过滤籽提取物和吸管2 40-50微升籽提取物的液滴成1或2口井。在一个时间只有1或2滴筛选防止样品的蒸发。
2. 将50微升新鲜的隔离缓冲液（1洗^ST下降）在不同的投影片的井前准备。在一个有盖的，湿热试验箱，防止水分蒸发，保持这张幻灯片。

3.2屏幕，清理，收集

1. 筛选胚胎籽提取物的液滴，在10倍的放大倍率目标所需的舞台。如果有必要，确认阶段，与20倍的放大倍率。胚胎通常会沉至底部的滑动。
2. 手动清除杂物围绕胚胎的钨针，胰岛素针或类似设备。
3. 将玻璃毛细管附近的胚胎，使用显微操作器，吨阿克了胚胎，用尽可能小的解决方案。
4. 收集几个胚胎（ 例如，所有的液滴），并释放他们在洗^ST下降（分子应用程序）或在目标缓冲区（细胞学）。每个收集轮应保持在5-10分钟和胚胎必须被收集在（所有收集轮的总体积应为<5微升）最小体积。
5. 重复筛选和收集在^第一洗涤下拉，直到所需量的胚胎被收集（集中，如果可能的话，以方便回忆）。
6. 记得所有的胚胎从洗降（如果碎片结转，用针之前删除它们回忆）。
7. 松开胚胎成^第二洗涤下拉为50μl。重复3.2.6。
8. 松开目标缓冲区中的胚胎。该转让应涉及接触，而不是浸泡，毛细管末端。
9. 更换microcapil下一个样品LARY。

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结果

洗涤胚胎分离过程（ 图1），允许多达隔离如果洗涤液进行的分子的应用程序， 例如在4小时中的40个胚胎，或在不到一个小时，如果省略， 例如用于细胞学应用。 图2显示高和低品质微细的提示和图3示出的胚胎分离机的安装，在倒置显微镜上， 图4显示的过程中，胚胎隔离。

我们成功地应用于我们最近几篇文章...

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讨论

我们开发了一个胚胎隔离协议，它是快速，有效，并可以很容易地转移到其他实验室。

这里所叙述的设备包括倒置显微镜，显微操作，玻璃微毛细管，垂直灯丝拉出器和微量注射器（ 图3A）。其设置与一个单一的动物细胞分离的转录组学分析^17。我们还成功地与玻璃微毛细管手动伸过来的火焰（切带菱形刀片），并通过标准实验室移液器（P-200的Pipetman）?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies