から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

要約

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告するシロイヌナズナ種。最大40胚には、下流のアプリケーションに応じて、1時間〜4時間で単離することができる。手順は、DNAのメチル化は、レポーター遺伝子の発現、および免疫蛍光トランスクリプトームのために適しているその場でハイブリダイゼーション分析。

要約

胚乳 - - 母親の種子の外皮（または種皮）に囲まれた顕花植物では、胚は栄養組織内で開発しています。その結果、初期段階（球状ステージに1セル）での植物の胚の分離が技術的にそれらの相対的な到達不能のために挑戦している。早い段階での効率的な手動の郭清が強く若いシロイヌナズナ種子のサイズが小さく、周囲の組織への胚の接着性によって損なわれている。ここでは、下流のアプリケーションに応じて、1時間〜4時間で40胚まで降伏、若いシロイヌナズナ胚の効率的な分離を可能にする方法について説明します。胚はわずかにエッペンドルフチュー​​ブ内でプラスチック乳棒で250から750種を粉砕することにより単離緩衝液中に放出される。ガラスピペット（ゴムチューブを介して）または油圧制御マイクロインジェクターを滴場所から胚を収集するために使用される標準的な実験室のどちらかに接続されているマイクロキャピラリー倒立光学顕微鏡にマルチウェルスライド上のD。必要な技術的なスキルは、シンプルかつ簡単に譲渡され、基本的なセットアップは、高価な機器を必要としません。収集された胚は、例えばRT-PCR、RNA配列決定、DNAメチル化分析、in situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光、免疫染色、およびレポーター遺伝子アッセイなどの下流の種々の用途に適している。

概要

顕花植物の胚は胚乳、第二の受精イベントから派生した栄養組織に囲まれています。胚と胚乳の両方が種皮のいくつかの細胞層に囲まれています。総称して、これらの組織は、果実内部で開発する種子を形成。このように、組織及びシロイヌナズナ胚の細胞特異的な分析が強く、その到達不能が損なわれている。それにもかかわらず、後期球状以降の段階で胚は比較的よく実体顕微鏡下に細いタングステン針を使用して手動で切開の影響を受けやすい、またはそれらを抽出するために鉗子を使用して種子にわずかな圧力を加えることによってです。このような技術は、正常トランスクリプトームまたはそのようなマイクロアレイハイブリダイゼーション、バイサルファイトシークエンシング、又はRNA配列決定（ 例えば ^1-3）としてエピゲノムプロファイリング解析に用いた。これとは対照的に、初期の球状ステージへの受精卵における胚の研究は技術的に困難なままです。現在までに、唯一のいくつかの研究では、担当者が持っている固定シードセクション⁴ま ​​たは罰金ツール^5を使用して、種子の中から個々の胚の手動抽出から胚組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のいずれかを使用して若い胚でortedトランスクリプトーム解析。しかし、LCM装置は早い段階で一般的に利用可能と手動胚抽出ではないことは、時間が容易譲渡することはできません優れた解剖のスキルを消費して必要である。ゲノムワイドな解析に加えて、 その場遺伝子発現解析は、 シロイヌナズナの若者、ホールマウント胚で実行することも困難である。ある程度まで、若い胚は種子穏やかな圧力によって顕微鏡スライド上に解放することができ、（例えば^6,7を参照）免疫染色によりレポーター遺伝子アッセイまたはタンパク質検出に使用される。この技術は、しかしながら、このようにして定量分析を妨げ、高スループット胚を分離することはできません。

したがって、我々は、効率的かつ迅速なプロトコルを開発した、簡単に譲渡、下流の様々なアプリケーションに適した設定が簡単であるシロイヌナズナ種子から初期胚の分離のために。適切な分離バッファにプラスチック乳棒を用いてエッペンドルフチュー​​ブの若い長角果から解剖 - 基本的な原理は、優しく、種子を粉砕することです。種子抽出物は、マルチウェルスライド上に液滴内に配置され、倒立顕微鏡を用いて所望の段階で放出胚の存在についてスクリーニングする。胚をマイクロインジェクターまたは標準的な実験室ピペットに装着マイクロキャピラリーガラスを使用して収集されます。分子のアプリケーションでは、胚は最小限のボリュームで宛先バッファに転送する前に、新しい分離バッファの滴に繰り返さリリースで2回洗浄する。細胞学的アプリケーション（レポーターアッセイ、免疫染色、FISH）、洗濯手順については省略することができます。

方法はいくつかの利点を提供します：（i）は、それは細胞学的アプリケーションのための〜45分で25-40の胚が得られlicationsまたは分子アプリケーション用の3-4時間で（洗浄ステップを含む）、（ⅱ）、特定胚の段階の分離を可能にし、（ⅲ）それは、その簡単なセットアップのために他の人や研究室へ簡単に譲渡され、（ⅳ）、それはアップグレードに従順である基本的なセットアップのための手頃な価格の機器が必要であり、および（v）それは正常なRNAシーケン^8、遺伝子特異的なDNAメチル化分析^9、レポーターアッセイ^（10 Raissig らなど、様々なダウンストリームアプリケーションに使用されました）。準備、およびFISH（J.イェーニッシュ、U. Grossniklaus、未発表C. Baroux、 図5を参照）。

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プロトコル

手順は、 図1に示すフローチャートに要約されている。マイクロキャピラリーや楽器のセットアップを図2及び図3に示されており、胚の分離の一般的な手順を図4に示す。

1。材料およびバッファの準備

ガラスマイクロキャピラリーの1.1シリコンコーティング

1. Sigmacote（シグマ）の〜5mlで15ミリリットルファルコンチューブにマイクロキャピラリーを置き、数回転倒。
2. 溶液を除去し、60℃でアルミホイルで毛細血管を含むファルコンチューブを配置し、3時間のためにそれらを焼く室温で保管してください。

1.2〜50〜100μmの直径のマイクロキャピラリーチップを入手

1. 手動でブンゼンバーナーの上または商業プラー（垂直フィラメントプラーまたはマイクロピペットプラー）を使用して、どちらか1ミリメートル口径ガラスキャピラリーを引き出します。
2. ダイヤモンドを使用してください先端のペンまたは所望の開口部を作成するために引っ張らキャピラリーの先端を切断する刃。実体顕微鏡下で最高の形の毛細血管を選択します。開口部は、50〜100ミクロン（ 図2）である必要があります。

1.3スライドの準備

1. 5分間Sigmacote（〜1ミリリットル/スライド）を持つすべての井戸を覆うことにより、クリーンなスライドをシリコーンで覆う、取り外します。アルミホイルで焼く3時間。室温で保管してください。
2. 10％SDS、ヌクレアーゼフリー水（DEPC-のddH ₂ Oをオートクレーブ）、70％エタノールで2分、100％エタノールで2分間、空気中で2×2分で10分間のマルチウェルガラス顕微鏡スライドを洗う乾いた。すべてのステップはオートクレーブコプリンジャーで行われます。スライドは、各使用の間の徹底したクリーニングを提供することを複数回再利用することができる。
3. 直前胚分離普及〜100.5μlのmg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）を各ウェルと空気乾燥の全面ピペットで。

1.4顕微鏡とキャピラリセットアップ

1. 10倍と20倍の倍率を目的とした倒立顕微鏡を使用してください。光のコントラストを最適化する（胚はかなり透明である）。
2. 顕微鏡の横にあるガラスキャピラリーを保持するために、マイクロマニピュレータを配置します。キャピラリーガラスがゴムチューブを介してマイクロインジェクター（ 図3A）または正規のP-200ピペットに接続されている（ 図3B、このセットアップの詳細については説明を参照）。
3. 〜70°の角度で顕微鏡スライド（ 図3）の上にキャピラリーを配置し、視野内の開口部を持つ位置を調整します。
4. 直前の胚の分離にコート毛細血管までかかると放し〜5-10μlのBSA（1 mg / ml）で。

1.5バッファ

表1は、下流のアプリケーションに応じて分離し、先のバッファを示しています。

1. 〜サンプル当たり1ミリリットル分離バッファが新たに前に使用し、氷の上でそれを維持する準備。
2. 氷（分子アプリケーション）または湿潤チャンバー内顕微鏡スライド（細胞学的アプリケーション）で0.5ミリリットルエッペンドルフ低結合チューブに宛先バッファを準備します。

2。シード解剖と胚抽出

種子開発の2.1同期

1. 花を去勢し、他の花で露光雌しべとの接触を回避しながら、成長室に2日間保管してください、その後、（ 例えば ^11）、それらを受粉。
2. クリア種子の微視的調査することにより、成長条件の下で開発の段階をテストします。当社の成長条件で（21で16時間明°C、18暗所8時間℃、70％湿度）種子は2.5日受粉後に収集（DAP）は、主に2-4細胞胚および種子は3.5収集もたらした - 4 DAPは球状もたらし胚。

2.2シード解剖と破裂

1. Sを削除鉗子とインスリン針で実体顕微鏡下10-15長角果（〜2.5 DAP）からeeds。
2. 氷上に置き2ミリリットル丸底エッペンドルフチュー​​ブに20μlの分離バッファ内の種子を浸す。
3. 穏やか種子抽出物が濁っなるまで胚を放出するプラスチック乳棒（DEPC-のddH ₂ Oで洗浄し、70％エタノールで洗浄し、10％SDSで洗浄済み）を用いて種子をつぶす。適用するための力は、トライアルの際、すべてのユーザによって決定されるべきである。
4. 杵を洗って、サンプルを希釈する分離バッファ300μlのと乳棒をすすぐ。
5. スピンダウン5秒5,000×gで抽出。優しく上下2〜3回ピペッティングしてペレット化エキスを再懸濁。
6. 30μmのナイロンメッシュ（PartecCelltricks などから、チューブアダプタに取り付けられた）とエキスをフィルタリング。追加の200μlの分離バッファとメッシュをすすぐ。

3。胚の分離

3.1スライドの準備

<李>場所倒立顕微鏡のステージ上でクリーン、BSA-コーティングとシリコン処理マルチウェルスライドは、上下に軽くピペッティングによってフィルタリング種子エキスを再懸濁および1または2ウェルに40〜50μlの種子エキスの2滴をピペット。一度に1〜2滴をスクリーニングすると、サンプルの蒸発を防ぎます。
1. 前のようにして調製異なるスライドのウェル内の新鮮な分離バッファの代わりに50μlの（1 ^回目の洗浄の低下）。蒸発を防ぐために覆われ、湿度の高い室内でこのスライドしてください。

3.2画面、きれい、収集

1. 10倍の倍率の対物レンズで所望の段階で胚のための種子エキスの液滴を選別。必要であれば、20倍の倍率でのステージを確認。胚は通常スライドの底に沈む。
2. 手動タングステン針、インスリン注射針または類似の機器と胚の周り破片を除去。
3. T、マイクロマニピュレータを用いた胚の近くにガラスキャピラリーを移動できるだけ少ないソリューションとして持つ胚までAKE。
4. いくつかの胚を（ 例えばすべて1滴）を収集及び^第 1 ^洗浄ドロップ（分子アプリケーション）または宛先バッファ（細胞学的ア ​​プリケーション）でそれらを解放。 （すべて収集ラウンドの総容積は<5μlのでなければなりません）、最小限のボリュームに収集することができるべきである各収集ラウンドは5〜10分であり、胚内に保持されるべきである。
5. 胚の所望の量を1 ^回目の洗浄の低下（中心、可能であれば、記憶を容易にする）で収集されるまで、スクリーニングやコレクションを繰り返します。
6. 洗浄降下（破片が回想前に針でそれらを削除し、引き継がれている場合）から、一度にすべての胚を思い出す。
7. 50μlの2 ^回目の洗浄ドロップに胚を離します。 3.2.6を繰り返します。
8. 宛先バッファに胚を離します。転送は、キャピラリー先端の唯一の接触はなく、浸漬し、関与させるべきである。
9. microcapilを交換次のサンプルのためのラリー。

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結果

洗浄、分子のアプリケーションに、または洗浄の細胞学的ア ​​プリケーションのために、たとえば 、省略されている場合、時間足らずで例えば 、実行している場合は私たちの胚の分離手順（ 図1）は、4時間で40胚までの分離を可能にします。2ディスプレイ高低図品質マイクロキャピラリー先端と図3は胚分離機のセットアッ?...

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ディスカッション

我々は、効果的な、迅速で胚分離プロトコルを開発し、容易に他の研究所に転送することができる。

ここで説明する機器は、倒立顕微鏡、マイクロマニピュレータ、ガラスマイクロキャピラリー、縦フィラメントプラーとマイクロインジェクター（ 図3A）で構成されています。セットアップは、トランスクリプトミクス解析¹⁷のための単一の動物細?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies