نموذج مثلي إضاءة الحيوية من سرطان البنكرياس التقدم

Summary

هناك حاجة إلى تحسين فهم بيولوجيا سرطان البنكرياس حاسمة لتمكين وضع خيارات علاجية أفضل لعلاج سرطان البنكرياس. لتلبية هذه الحاجة، ونحن لشرح نموذج مثلي من سرطان البنكرياس الذي يسمح للرصد غير الغازية من تطور سرطان باستخدام في الجسم الحي التصوير تلألؤ بيولوجي.

Abstract

Introduction

سرطان البنكرياس هو رابع سبب رئيسي للوفاة المتصلة بالسرطان، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات من ^{4-6٪، 1،2} 15٪ فقط من المرضى يتم تشخيصهم في وقت مبكر بما فيه الكفاية في هذا المرض ليكون مؤهلا لإجراء عملية جراحية، والأورام تتكرر في> 80٪ من هؤلاء المرضى. يستخدم ^3،4 جيمسيتابين لعلاج الأورام الغدية السرطانية البنكرياس، ومع ذلك، مقاومة كيميائية هو شائع وغالبا ما يكون الدواء له تأثير يذكر على البقاء على قيد الحياة عموما. هناك حاجة ماسة ⁵ استراتيجيات الدوائية جديدة لعلاج سرطان البنكرياس. تنميتها يعتمد على تحسن كبير في فهم الخطوات الرئيسية لتطور المرض التي قد تكون حساسة لتدخل علاجي.

نماذج مثلي من سرطان البنكرياس تحاكي جوانب رئيسية من الأمراض التي تصيب البشر، مما يجعلها أدوات مثالية لدراسة علم الأحياء من سرطان البنكرياس. ^6-9 وعلى النقيض من في المختبر المقايسات خلية مقرها من سرطان البنكرياس سلوك الخلية عند تحت الجلد في النماذج الحية من سرطان البنكرياس، ونماذج مثلي تسمح التحقيق في التفاعلات الخلايا السرطانية مع المكروية البنكرياس. حركية تطور المرض هي تكرار للغاية في نماذج مثلي وتحدث على مدى فترة زمنية قصيرة (أسابيع)، مما يجعلها مناسبة تماما لاختبار ما قبل السريرية لعلاجات جديدة. هذا هو على النقيض من النماذج المعدلة وراثيا حيث تحدث بداية ظهور أعراض المرض على مدى زمني أطول وأكثر متغير (أشهر إلى سنة 1). ¹⁰ عندما تستخدم مع خطوط الخلايا أكثر عدوانية، ونماذج مثلي من سرطان البنكرياس لديهم أنماط من ورم خبيث عفوية مماثلة لتلك التي ظهرت في المرضى. ⁸ التعبير عن جينات مراسل إضاءة الحيوية مثل luciferase يراعة يسهل الرصد الطولي للنمو الورم، ونشر النقيلي، تكرار وردا على التداوي. ^6،11

نحن هنا وصف نموذج مثلي من سرطان البنكرياس التي تستخدم MATRIGEL للتسليم خلية محلية والتصوير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي لرصد غير الغازية من تطور الورم. هذا نموذج مثلي من سرطان البنكرياس يسمح التحليلات غير الغازية من تطور المرض والاستجابة للتدخلات العلاجية في نماذج syngenic أو طعم أجنبي.

Protocol

يتم تنفيذ بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة من مؤسسة رعاية الحيوان المؤلف واللجنة الاستخدام. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة.

1. Transducing سرطان البنكرياس خطوط الخليوي

1. خلايا سرطان البنكرياس تنبيغ للتعبير عن وسيفيراز كما هو موضح سابقا. ^12،13 بانكايك ه-1-1 وCapan البنكرياس خطوط الخلايا السرطانية ترانسدوسيد مع luciferase يراعة تستخدم هنا.

ملاحظة: يمكن أيضا وسيفيراز Renilla أو وسيفيراز البكتيرية استخدامها.

2. سرطان البنكرياس خلية التحضير

1. ثقافة ترانسدوسيد خلايا سرطان البنكرياس حتى 70٪ متموجة.
2. رفع خلايا البنكرياس وضمان بقاء أكبر من 90٪.
3. Resuspend في 2 × 10 ⁷ خلية / مل في خليط 03:02 من Matrigel مبردة: الفوسفات مخزنة SALالمعهد الوطني للإحصاء (PBS).
4. إبقاء التعليق على Matrigel الخلية على الجليد قبل الحقن في البنكرياس.

ملاحظات: لضمان التصلب السريع للMatrigel، والحد من حجم PBS لحساب حجم الخلية بيليه. التعامل مع Matrigel باستخدام أدوات الجليد الباردة والمحاقن في جميع الأوقات لمنع التصلب قبل الحقن. عدد الخلايا اقترح هو دليل وينبغي أن تحدد تجريبيا لكل خط الخلية.

3. إعداد الماوس

1. تخدير الماوس باستخدام استنشاقه 2-3٪ isoflurane و. تحديد عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة لقرصة اصبع القدم لطيف.
2. تطبيق مواد التشحيم للعيون لمنع جفاف.
3. ضع الماوس على ظهرها على 37 درجة مئوية وسادة التدفئة وتشغيل بلطف الماوس لرفع الجانب الأيسر من البطن.
4. إعداد البطن مع 10٪ البوفيدون محلول اليود.

ملاحظات: Injectabجنيه التخدير يمكن أن تستخدم بدلا من التخدير بالاستنشاق. الصيام قبل العملية ليست ضرورية.

4. البطن

1. استخدام الأدوات الجراحية المعقمة جعل 1.5 سم شق في الجلد حوالي 1 سم الجانبي الأيسر من خط الوسط.
2. جعل شق 1.5 سم في عضلة البطن الأساسية.
3. حدد موقع الطحال باستخدام ملقط وإزالة بلطف والطحال من تجويف البطن. تأمين الطحال على طول برعم القطن المعقم لفضح البنكرياس الكامنة.
4. تحديد موقع الذيل من البنكرياس المتاخمة للالطحال.
5. باستخدام 29 G 0.3 مل حقنة الأنسولين، وضخ 20 ميكرولتر من التعليق على Matrigel خلية في البنكرياس.
6. بعد الحقن، والاستمرار على حقنة في البنكرياس لمدة 30-60 ثانية حتى وطدت Matrigel. هذه الخطوة الهامة يقلل من تسرب الخلية.
7. تفقد موقع الحقن لضمان حدثت أي تسرب.
8. عودة الطحال والبنكرياس إلى تجويف البطن.

ملاحظة: احرص على تجنب ثقب الجانب الظهري من البنكرياس والتي قد تكون رقيقة.

5. إغلاق جدار البطن

1. إغلاق الجهاز العضلي في البطن من الفأرة مع خياطة 4-0 مضفر امتصاص بإبرة جولة باستخدام غرزة المستمر.
2. إغلاق الجلد الخارجية مع غير قابل للامتصاص حيدة 6-0 خياطة بإبرة القطع باستخدام غرزة المستمر.
3. إزالة الماوس من مخدر المستنشق وحقن 0.05-0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد.
4. السماح للماوس على التعافي في قفصه وضعت على 37 ° C سادة التدفئة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. إذا الفئران تظهر علامات للألم مثل hunching أو إعاقة حركية، بوبرينورفين قد تعطى كل 12 ساعة على مدى فترة 36 ​​ساعة.
5. بعد التئام الجروح (7-10 أيام)، تخدير الماوس وإزالة الخيوط الجراحية الخارجية.

6. تتبع إضاءة الحيوية من كانكون البنكرياسإيه التقدم

1. تخدير الماوس باستخدام استنشاق isoflurane و.
2. حقن 150 ملغم / كغم D-وسيفيرين عبر الوريد الذيل.
3. ضع الماوس في نظام التصوير إضاءة الحيوية والتقاط الصور البيضاء الخفيفة وتلألؤ بيولوجي كما هو موضح سابقا. ^14،15
4. إزالة الماوس من مخدر المستنشق والسماح لها للتعافي في قفص وطنه.

ملاحظة: إضاءة الحيوية التصوير هو غير الغازية ويمكن أن تجرى بشكل دوري للتحقيق حركية نمو الورم. لورم الصورة في ذيل البنكرياس من المهم وضع الماوس على جانبها الأيسر، وبالتالي فإن نقاط ورم في اتجاه الكاميرا. نحن تصويرها مرة واحدة في الأسبوع مع زيادة تردد تصل إلى ثلاث مرات في الأسبوع قبل نقطة النهاية التجريبية باستخدام نظام التصوير الثاني لومينا (بيركن، إلمر، سابقا الفرجار علوم الحياة) تشغيل المعيشة البرمجيات 4.3.1 التصوير مع binning 4، FOV 12.5، F-1 توقف، والتعرض 1-60 ثانية (يحدده أعلى إكسبosure دون التشبع بكسل).

النتائج

يصف هذا الأسلوب نموذج مثلي من سرطان البنكرياس باستخدام العمليات الجراحية، بما في ذلك تحريض التخدير، البطن، حقن الخلايا السرطانية في إغلاق Matrigel والبطن (الشكل 1A). حقن الخلايا تشكيل فقاعة في سطح البنكرياس (1B الشكل). تطور سرطان البنكرياس قد يكون رصدها ب...

Discussion

نحن هنا وصف نموذج مثلي لتقييم الطولي للتنمية ورم البنكرياس والتقدم. حركية نمو الورم الرئيسي هي استنساخه (الشكل 3) ويمكن رصد غير جراحية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا وسيفيراز الموسومة، على سبيل المثال لتحليل استجابة الورم للرواية علاجات الس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913