Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

Resumo

Uma melhor compreensão da biologia do câncer de pâncreas é criticamente necessário para permitir o desenvolvimento de melhores opções terapêuticas para o tratamento de câncer no pâncreas. Para atender a essa necessidade, nós demonstramos um modelo ortotópico de câncer pancreático que permite o monitoramento não-invasivo de progressão do câncer usando In vivo Imagem de bioluminescência.

Resumo

Introdução

O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 4-6%. ^1,2 Apenas 15% dos pacientes são diagnosticados logo no início da doença para ser elegível para a cirurgia, e os tumores se repetir em> 80% dos pacientes. ^3,4 gemcitabina é utilizada para o tratamento do adenocarcinoma pancreático, no entanto, quimiorresistência é comum e muitas vezes a droga tem pouco impacto na sobrevivência global. ^cinco novas estratégias farmacológicas para o tratamento de cancro pancreático são urgentemente necessárias. Seu desenvolvimento depende melhorou significativamente a compreensão das principais etapas de progressão da doença que podem ser sensíveis à intervenção terapêutica.

Modelos ortotópico de câncer de pâncreas emular os principais aspectos da doença humana, tornando-as ferramentas ideais para o estudo da biologia do câncer de pâncreas. ^6-9 Em contraste com os ensaios in vitro com células de comportamento de células de câncer de pâncreas umad subcutânea modelos in vivo de câncer de pâncreas, os modelos ortotópico permitir a investigação das interações de células tumorais com o microambiente pancreático. A cinética de progressão da doença são altamente reprodutível em modelos ortotópico e ocorrem ao longo de um curto espaço de tempo (semanas), o que os torna adequados para testes pré-clínicos de novas terapias. Isto está em contraste com os modelos transgénicos, onde o início da doença ocorre ao longo de um período mais e mais variáveis ​​de tempo (meses a 1 ano). ¹⁰ Quando utilizado com linhas de células mais agressivas, os modelos ortotópicos de cancro do pâncreas têm padrões de metástases espontâneas semelhantes aos observados em pacientes. ⁸ Expressão de genes repórter bioluminescentes como vaga-lume luciferase facilita o acompanhamento longitudinal do crescimento tumoral, disseminação metastática, recorrência e resposta à terapêutica ^6,11.

Aqui nós descrevemos um modelo ortotópico de câncer pancreático que utiliza Matrigel para entrega localizada de células e em imagiologia in vivo de bioluminescência para monitorização não invasiva da progressão do tumor. Este modelo ortotópico de câncer pancreático permite análises não invasivas de progressão da doença e resposta a intervenções terapêuticas em modelos singênicos ou heteróloga.

Protocolo

O protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação de cuidados com os animais da instituição do autor e comitê uso. Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras.

1. Transdução pancreáticas linhas celulares de cancro

1. Transduzir as células de cancro do pâncreas para expressar luciferase, tal como descrito anteriormente. ^12,13 Panc-1 e Capan-1 linhas de células de cancro pancreático transduzidas com luciferase do pirilampo são usados ​​aqui.

Nota: a luciferase de Renilla, ou luciferase bacteriana podem também ser usados.

2. Pancreatic Cancer celular Preparação

1. Cultura transduzidas células de câncer pancreático até 70% confluentes.
2. Levante as células pancreáticas e assegurar a viabilidade é superior a 90%.
3. Ressuspender a 2 x 10 ⁷ células / ml numa mistura 03:02 de Matrigel refrigerados sal fosfato tamponadoine (PBS).
4. Manter a suspensão de células de Matrigel em gelo antes da injecção no pâncreas.

Notas: Para assegurar uma rápida solidificação de Matrigel, reduzir o volume de PBS para ter em conta o volume do sedimento celular. Pega Matrigel utilizando instrumentos gelados e seringas em todos os momentos para evitar a solidificação, antes da injecção. O número de células é sugerido um guia e deve ser determinada empiricamente para cada linha celular.

3. Rato Preparação

1. Anestesiar o mouse usando inalado 2-3% de isoflurano. Determinar a profundidade da anestesia por falta de pedal reflexo de uma pitada dedo gentil.
2. Aplique lubrificante para os olhos para evitar a dessecação.
3. Posicione o mouse sobre a sua volta em uma almofada de aquecimento ° C 37 e vire suavemente o mouse para levantar o lado esquerdo do abdômen.
4. Preparar o abdómen com uma solução a 10% de iodo povidona.

Notas: Injectable anestesia pode ser usado em vez da anestesia por inalação. Jejum pré-operatório, não é necessário.

4. Laparotomia

1. Usando instrumentos cirúrgicos estéreis fazer uma incisão de 1,5 cm na pele de aproximadamente 1 cm lateral esquerdo da linha média.
2. Faça uma incisão de 1,5 cm no músculo abdominal subjacente.
3. Mostrar o baço utilizando a pinça e retirar cuidadosamente o baço a partir da cavidade abdominal. Fixe o baço ao longo de um cotonete estéril para expor o pâncreas subjacente.
4. Localizar a cauda do pâncreas adjacente ao baço.
5. Utilizando uma seringa de 0,3 ml de L insulina 29, injecta-se 20 ul da suspensão de células no pâncreas Matrigel.
6. Após a injecção, segure a seringa no pâncreas por 30-60 segundos até que o Matrigel solidificou. Este passo importante minimiza fugas célula.
7. Inspecione o local da injeção para garantir que não haja vazamento ocorreu.
8. Devolver o baço e pâncreas, na cavidade abdominal.

Nota: Tome cuidado para evitar a perfuração do lado dorsal do pâncreas que pode ser fino.

5. Fechamento da parede abdominal

1. Feche a musculatura abdominal do rato com uma sutura absorvível 4-0 trançada com uma agulha rodada meio de sutura contínua.
2. Feche a pele externa com um monofilamento não absorvível 6-0 com agulha cortante meio de sutura contínua.
3. Remova o mouse do anestésico inalatório e injetado 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina subcutânea.
4. Permitir que o rato se recuperar a sua gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento ° C, 37 º C com acesso livre a comida e água. Se os ratos demonstrar sinais de dor como hunching ou com mobilidade reduzida, a buprenorfina pode ser dada a cada 12 horas durante um período de 36 horas.
5. Após a cicatrização de feridas (7-10 dias), anestesiar o mouse e remover as suturas externas.

6. Rastreamento bioluminescente do Canc pâncreaser Progressão

1. Anestesiar o mouse usando isoflurano inalado.
2. Injectar 150 mg / kg de D-luciferina, através da veia da cauda.
3. Posicione o mouse no sistema de imagem de bioluminescência e capturar imagens de luz branca e bioluminescência como descrito anteriormente. ^14,15
4. Remova o mouse do anestésico inalatório e permitir que ele se recuperar em sua gaiola.

Nota: a imagem de bioluminescência é não-invasiva e pode ser realizada periodicamente para investigar a cinética de crescimento do tumor. Para tumor imagem na cauda do pâncreas é importante colocar o mouse sobre o seu lado esquerdo, de modo que os pontos do tumor para a câmera. Nós fotografada uma vez por semana com a freqüência aumentada até três vezes por semana, antes do ponto final experimental utilizando um sistema de imagem II Lumina (Perkin-Elmer, ex-Caliper Life Sciences) rodando software 4.3.1 Imagem de estar com binning 4, FOV 12.5, F-stop 1, exposição de 1 - 60 seg (determinada pela maior exposure sem saturação de pixels).

Resultados

Este método descreve um modelo ortotópico de câncer de pâncreas através de procedimentos cirúrgicos, incluindo a indução da anestesia, laparotomia, a injeção de células cancerosas no fechamento Matrigel e abdominal (Figura 1A). As células injectadas formar uma bolha na superfície do pâncreas (Figura 1B). A progressão do cancro do pâncreas podem ser monitorizados de forma não invasiva através de imagiologia in vivo bioluminescência para controlar a pr...

Discussão

Aqui nós descrevemos um modelo ortotópico de avaliação longitudinal do desenvolvimento do tumor de pâncreas e progressão. Cinética de crescimento do tumor primário são reprodutíveis (Figura 3) e podem ser não-invasiva monitorizada utilizando imagem de bioluminescência de células marcadas com luciferase, por exemplo, para análises da resposta do tumor a novas terapêuticas anti-cancro do pâncreas. Consistente com a doença humana, o modelo mostra invasão pancreático local

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913