Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

Resumen

Una mejor comprensión de la biología del cáncer de páncreas es una necesidad vital para permitir el desarrollo de mejores opciones terapéuticas para el tratamiento de cáncer de páncreas. Para hacer frente a esta necesidad, se demuestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que permite la monitorización no invasiva de la progresión del cáncer utilizando In vivo Imágenes de bioluminiscencia.

Resumen

Introducción

El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, con una tasa de supervivencia a 5 años del 4-6% ^1,2. Sólo el 15% de los pacientes son diagnosticados a tiempo de la enfermedad para ser elegibles para la cirugía, y los tumores se repiten en> 80% de los pacientes ^3,4. gemcitabina se utiliza para el tratamiento de adenocarcinomas de páncreas, sin embargo, quimio-resistencia es común y muchas veces la droga tiene poco impacto en la supervivencia global. ⁵ Nuevas estrategias farmacológicas para tratar el cáncer de páncreas son críticamente necesarios. Su desarrollo depende de mejorar significativamente la comprensión de los pasos clave de la progresión de la enfermedad que pueden ser sensibles a la intervención terapéutica.

Modelos ortotópico de cáncer de páncreas emulan aspectos clave de la enfermedad humana, haciéndolos herramientas ideales para el estudio de la biología del cáncer de páncreas. ^6-9 En contraste con los ensayos in vitro basados ​​en células de comportamiento de las células de un cáncer de páncreasd subcutánea en modelos in vivo de cáncer de páncreas, modelos ortotópico permitir la investigación de las interacciones de células tumorales con el microambiente de páncreas. La cinética de la progresión de la enfermedad son altamente reproducibles en los modelos ortotópico y se producen en un corto período de tiempo (semanas), lo que los hace muy adecuados para las pruebas de pre-clínico de nuevos tratamientos. Esto está en contraste con los modelos transgénicos donde inicio de la enfermedad se produce sobre un marco más largo y más variable de tiempo (meses a 1 año). ¹⁰ Cuando se utiliza con líneas de células más agresivas, modelos ortotópico de cáncer de páncreas tienen patrones de metástasis espontánea similares a las observadas en los pacientes. ⁸ Expresión de genes reporteros bioluminiscentes tales como la luciferasa de luciérnaga facilita el seguimiento longitudinal de crecimiento tumoral, diseminación metastásica, la recidiva y la respuesta a la terapéutica. ^6,11

A continuación se describe un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que utiliza MatrIgel para la entrega localizada de células e in vivo imágenes de bioluminiscencia para la monitorización no invasiva de la progresión del tumor. Este modelo ortotópico de cáncer de páncreas permite análisis no invasivos de progresión de la enfermedad y la respuesta a las intervenciones terapéuticas en modelos singénicos o xenoinjerto.

Protocolo

El protocolo que se está demostrado que se realiza bajo la supervisión y aprobación de cuidado de los animales de la institución del autor y el empleo. Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras.

1. Transducción de páncreas líneas celulares de cáncer

1. Transducir las células de cáncer de páncreas para expresar luciferasa como se ha descrito anteriormente. Capan-1 de páncreas líneas celulares de cáncer de ^12,13 Panc-1 y transducidas con luciferasa de luciérnaga se utilizan aquí.

Nota: luciferasa de Renilla luciferasa bacteriana o también se pueden usar.

2. Preparación de las células del cáncer de páncreas

1. Cultura transducidas células del cáncer pancreático hasta el 70% de confluencia.
2. Levante las células pancreáticas y asegurar la viabilidad es superior al 90%.
3. Volver a suspender en 2 x 10 ⁷ células / ml en una mezcla 3:2 de Matrigel refrigeradas: tamponada con fosfato Saline (PBS).
4. Mantener la suspensión de células Matrigel en hielo antes de la inyección en el páncreas.

Notas: Para garantizar una rápida solidificación de Matrigel, reducir el volumen de PBS para tener en cuenta el volumen del sedimento celular. Mango Matrigel usando instrumentos de hielo frío y jeringas en todo momento para evitar la solidificación antes de la inyección. El número de células que se sugiere es una guía y debe ser determinada empíricamente para cada línea celular.

3. Ratón Preparación

1. Anestesiar el ratón usando inhalado 2-3% isoflurano. Determine la profundidad de la anestesia por la falta de pedal reflejo de una pizca dedo del pie suave.
2. Aplique lubricante a los ojos para evitar la desecación.
3. Coloque el ratón en la espalda a un ° C almohadilla eléctrica 37 y gire suavemente el ratón para elevar el lado izquierdo del abdomen.
4. Preparar el abdomen con una solución de povidona yodada 10%.

Notas: InjectabLe anestesia puede ser utilizado en lugar de la anestesia inhalada. El ayuno pre-operatorio no es necesario.

4. Laparotomía

1. Utilizando instrumentos quirúrgicos estériles hacer una incisión de 1,5 cm en la piel de aproximadamente 1 cm lateral izquierda de la línea media.
2. Hacer un cm de incisión en el músculo abdominal subyacente 1.5.
3. Localice el bazo utilizando las pinzas y retire suavemente el bazo de la cavidad abdominal. Asegure el bazo por un bastoncillo de algodón estéril para exponer el páncreas subyacente.
4. Busque la cola del páncreas adyacente al bazo.
5. Uso de un G 0,3 ml jeringa de insulina 29, inyectar 20 l de la suspensión de células Matrigel en el páncreas.
6. Después de la inyección, mantenga la jeringa en el páncreas durante 30-60 segundos hasta que el Matrigel se ha solidificado. Este paso importante minimiza las fugas celular.
7. Inspeccionar el sitio de la inyección para asegurar que tuviera lugar ninguna fuga.
8. Volver el bazo y el páncreas a la cavidad abdominal.

Nota: Tenga cuidado de no perforar el lado dorsal del páncreas que puede ser delgada.

5. Cierre de la pared abdominal

1. Cierre la musculatura abdominal del ratón con una sutura trenzada absorbible 4-0 con una aguja redonda usando una puntada continua.
2. Cierre de la piel externa con un monofilamento no absorbible 6-0 sutura con una aguja de corte con una puntada continua.
3. Retire el ratón de la anestesia inhalada e inyectada 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
4. Deje que el ratón se recupere en su jaula colocada sobre una almohadilla térmica ° C 37 con acceso libre a comida y agua. Si los ratones muestran signos de dolor, como encorvarse o con movilidad reducida, la buprenorfina puede administrarse cada 12 horas durante un período de 36 horas.
5. Después de la cicatrización de heridas (7-10 días), anestesiar el ratón y retirar los puntos de sutura externos.

6. Seguimiento bioluminiscente de Canc páncreaser progresión

1. Anestesiar el ratón con isoflurano inhalado.
2. Inyectar 150 mg / kg de D-luciferina a través de la vena caudal.
3. Coloque el ratón en el sistema de imágenes bioluminiscentes y capturar imágenes de luz blanca y bioluminiscencia como se ha descrito anteriormente ^14,15.
4. Retire el ratón de la anestesia inhalada y permite que se recupere en su jaula.

Nota: bioluminiscente de imágenes es no invasivo y puede llevarse a cabo periódicamente para investigar la cinética de crecimiento del tumor. Para tumor imágen en la cola del páncreas, es importante poner el ratón sobre el lado izquierdo, por lo que los puntos tumorales hacia la cámara. Nos Toma de imágenes de una vez por semana con la frecuencia aumentó hasta tres veces por semana antes del punto final experimental utilizando un sistema de imagen II Lumina (Perkin-Elmer, anteriormente Caliper Life Sciences) que ejecuta el software 4.3.1 Imagen de estar con binning 4, FOV 12.5, F-parada 1, la exposición 1-60 seg (determinada por la más alta exposure sin saturación de píxel).

Resultados

Este método describe un modelo ortotópico de cáncer de páncreas usando procedimientos quirúrgicos, incluyendo la inducción de la anestesia, la laparotomía, la inyección de las células cancerosas en el cierre de Matrigel y abdominal (Figura 1A). Las células inyectadas forman una burbuja en la superficie del páncreas (Figura 1B). La progresión del cáncer de páncreas puede ser monitorizado de forma no invasiva en el uso de imágenes de bioluminiscencia in vivo

Discusión

Aquí se describe un modelo ortotópico para la evaluación longitudinal de desarrollo y la progresión del tumor de páncreas. La cinética de crecimiento del tumor primario son reproducibles (Figura 3) y pueden ser de forma no invasiva supervisado usando imágenes de bioluminiscencia de la luciferasa de las células marcadas con, por ejemplo, para el análisis de la respuesta del tumor a nuevas terapias contra el cáncer de páncreas. En consonancia con la enfermedad humana, el modelo muestra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913