췌장암의 진행 발광 동소 모델

요약

췌장암 생물학의 개선 이해는 매우 췌장암을 치료하는 더 나은 치료 옵션의 개발을 가능하게하기 위해 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 사용하여 암 진행의 비 침습 모니터링을 허용 췌장암의 동소 모델을 보여 생체 내 생물 발광 영상.

초록

서문

췌장암 4-6 %의 5 년 생존율, 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인이다. 환자의 ^1,2 단지 15 %는 수술을받을 수 질병 조기에 진단하고, 종양이 재발된다 >에서 그 환자의 80 %가. ^3,4 젬시 타빈은 췌장 선암의 치료에 사용된다, 그러나, chemoresistance는 일반적이고 자주 약물 생존율에 거의 영향을 미친다. 췌장암을 치료하는 새로운 ⁵ 약리 전략이 매우 필요합니다. 그들의 개발은 치료 적 개입에 민감 할 수 있습니다 질병의 진행의 주요 단계를 크게 향상 이해에 따라 달라집니다.

췌장암의 동소 모델은 췌장암의 생물학을 공부 그들을 이상적인 도구를 만드는 인간의 질병의 주요 측면을 모방. 췌장암 세포 행동의 체외에서 세포 기반 분석과는 달리 ^6-9췌장암의 생체 내 모델에서 D 피하는 동소 모델은 췌장의 미세와 종양 세포의 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 질병 진행의 반응 속도는 동소 모델에서 높은 재현성하고 잘 새로운 치료제의 전임상 시험에 적합하게 짧은 시간 프레임 (주)에 발생합니다. 이 질병의 발병이 더 많은 변수 기간 (개월 1 년) ^10. 더 공격적인 세포 라인과 함께 사용을 통해 발생 형질 전환 모델 대조적입니다, 췌장암의 동소 모델에서 본 것과 유사한 자연 전이의 패턴을 가지고 환자는. 같은 반딧불 루시 페라로 발광 리포터 유전자의 ⁸ 발현 종양 성장의 종 모니터링, 전이성 보급, 재발 및 치료에 대한 반응을 용이하게합니다. ^6,11

여기에 우리가 MATR을 활용 췌장암의 동소 모델을 설명종양 진행의 비 침습 모니터링을위한 지역화 된 세포 전달 및 생체 내 생물 발광 이미징에 대한 이젤. 췌장암이 동소 모델은 질병의 진행 및 syngenic 또는 이종 이식 모델에서 치료 개입에 대한 응답의 비 침습 분석을 할 수 있습니다.

프로토콜

증명되는 프로토콜은 저자의 기관의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다. 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행됩니다.

1. 췌장암 세포 라인을 transducing에

1. 앞에서 설명한대로 형질 도입 췌장암 세포는 루시 페라 제 표현. ^12,13 테드 스티븐스 - 1 Capan-1 췌장암 세포주 반딧불 루시 페라로 형질 여기에 사용됩니다.

참고 : Renilla의 루시 페라 나 세균 루시퍼도 사용할 수 있습니다.

2. 췌장암 세포의 준비

1. 문화가 70 % 합류 할 때까지 췌장암 세포를 형질.
2. 췌장 세포를 올리고 가능성 90 % 이상되어 있는지 확인합니다.
3. 냉장 마트 리젤의 3:2 혼합물에서 2 × 10 ⁷ 세포 / ML에 resuspend을 : 인산 염은 버퍼오프라인 (PBS).
4. 이전 췌장에 주입 얼음 마트 리젤 세포 현탁액을 유지합니다.

참고 : 마트 리젤의 빠른 응고을 보장하기 위해, 세포 펠렛의 양을 고려하여 PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다. 이전 주입 응고를 방지하기 위해 항상 얼음처럼 차가운 악기와 주사기를 사용하여 마트 리젤을 처리합니다. 제안 된 휴대폰 번호는 가이드와 각 세포주에 대해 경험적으로 결정되어야한다.

3. 마우스 준비

1. 2-3% isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취. 부드러운 발가락 핀치에 페달 반사의 부족에 의한 마취의 깊이를 결정합니다.
2. 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바릅니다.
3. 37 ° C 가열 패드의 뒷면에 마우스를 놓고 조심스럽게 복부의 왼쪽을 높이기 위해 마우스를 켭니다.
4. 10 % 포비돈 요오드 용액으로 복부를 준비합니다.

참고 : Injectab르 마취 흡입 마취 대신 사용할 수 있습니다. 수술 전 금식이 필요하지 않습니다.

4. 개복술

1. 불임 수술기구를 사용하면 대략 1 센티미터 정중선에서 옆 왼쪽​​으로 피부에 1.5 cm의 절개를합니다.
2. 기본 복부 근육에 1.5 cm의 절개를합니다.
3. 집게를 사용하여 비장을 찾아 부드럽게 복강에서 비장을 제거합니다. 기본 췌장을 노출하는 멸균 면봉에 따라서 비장을 보호합니다.
4. 비장에 인접한 췌장의 꼬리를 찾습니다.
5. 29 G 0.3 ML 인슐린 주사기 사용, 췌장에 마트 리젤 세포 현탁액의 20 μl를 주입.
6. 마트 리젤이 응고 할 때까지 주입 후, 30 ~ 60 초 동안 췌장에 주사기를 누릅니다. 이 중요한 단계는 세포의 누출을 최소화합니다.
7. 누설이 발생하지 확인하기 위해 주사 부위를 검사합니다.
8. 복강에 비장과 췌장을 반환합니다.

참고 : 얇은 될 수있는 췌장의 등쪽면을 펑 쳐링 않도록주의하십시오.

5. 복부 벽 마감

1. 연속 스티치를 사용하여 원형 바늘로 흡수 꼰 4-0 봉합사와 마우스의 복부 근육을 닫습니다.
2. 연속 스티치를 사용하여 절단 바늘 비 흡수성 필라멘트 6-0 봉합사로 외부 피부를 닫습니다.
3. 흡입 마취제 및 피하 주입 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀에서 마우스를 제거합니다.
4. 마우스가 음식과 물을 무료로 이용할와 37 ° C 가열 패드에 배치의 새장에 복구 할 수 있습니다. 쥐 같은 hunching 또는 감소 이동성 고통의 흔적을 보여 경우, 부 프레 노르 핀은 36 시간에 걸쳐 매 12 시간을 부여 할 수 있습니다.
5. 상처 치유 (7-10 일) 후, 마우스를 마취와 외부 봉합을 제거합니다.

6. 췌장 Canc의 발광 추적어 진행

1. isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취.
2. 꼬리 정맥을 통해 150 ㎎ / ㎏ D-루시페린을 주입.
3. 발광 생물 이미징 시스템에 마우스를 놓고 앞에서 설명한대로 백색 빛과 생물 발광 영상을 캡처합니다. ^14,15가
4. 흡입 마취에서 마우스를 제거하고 그것의 홈 케이지에 복구 할 수 있습니다.

참고 : 바이오 루미 네 센트 영상은 비 침습적이며, 종양의 성장 속도론을 조사하기 위해 정기적으로 실시 할 수 있습니다. 췌장 꼬리의 이미지 종양에 그것의 왼쪽에 마우스를두고하는 것이 중요합니다, 카메라를 향해 종양 점 때문에. 주파수 전에 FOV 12.5 비닝 (binning) 4와 함께 살고 이미징 4.3.1 소프트웨어를 실행하는 루미나 II 이미징 시스템 (퍼킨 - 엘머, 이전 캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 실험 끝점에 일주일에 세 번까지 증가로 우리는 일주일에 한 번 군데 F-스톱 1, 노출 1-60 초 (높은 경험치에 의해 결정픽셀의 채도없이 osure).

결과

이 방법은 마취 유도, 개복술, 마트 리젤 및 복부 폐쇄 (그림 1A)에서 암 세포의 주입 등의 수술 절차를 사용하여 췌장암의 동소 모델을 설명합니다. 주입 된 세포는 췌장의 표면에 거품 (그림 1B)를 형성한다. 췌장암의 진행은 비 침습적 암 세포 증식 및 보급 (그림 2)를 추적하는 생체 생물 발광 이미징에 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 간 전?...

토론

여기에서 우리는 췌장 종양 개발 및 진행의​​ 경도 평가를위한 동소 모델을 설명합니다. 기본 종양의 성장 속도론을 재현 할 수있다 (그림 3)과 새로운 안티 - 췌장암 치료에 대한 종양 반응의 분석 예 : 루시 페라 제 태그가 세포의 생물 발광 영상을 사용하여 비 침습적으로 모니터링 할 수 있습니다. 인간의 질병과 일치 모델은 췌장의 미세와 종양 세포의 상호 작용을 조사 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913