Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

Résumé

Une meilleure compréhension de la biologie du cancer du pancréas est critique nécessaire pour permettre le développement de meilleures options thérapeutiques pour traiter le cancer du pancréas. Pour répondre à ce besoin, nous démontrons un modèle orthotopique de cancer du pancréas qui permet une surveillance non invasive de la progression du cancer à l'aide In vivo Imagerie par bioluminescence.

Résumé

Introduction

Le cancer du pancréas est la quatrième cause de décès liée au cancer, avec un taux de survie à 5 ans de 4-6%. ^1,2 Seulement 15% des patients sont diagnostiqués assez tôt dans la maladie pour être admissible à la chirurgie, et les tumeurs réapparaissent à> 80% de ces patients. ^3,4 gemcitabine est utilisé pour le traitement des adénocarcinomes pancréatiques, cependant, la chimiorésistance est commun et souvent le médicament a peu d'impact sur ​​la survie globale. ⁵ nouvelles stratégies pharmacologiques pour le traitement du cancer du pancréas est critique nécessaire. Leur développement dépend considérablement amélioré la compréhension des étapes clés de la progression de la maladie qui peuvent être sensibles à l'intervention thérapeutique.

Orthotopiques modèles de cancer du pancréas émulent les principaux aspects de la maladie humaine, faisant d'eux des outils idéaux pour étudier la biologie du cancer du pancréas. ^6-9 Contrairement aux essais in vitro du comportement des cellules de cancer du pancréas à base de cellules d'und sous-cutanée dans des modèles in vivo de cancer du pancréas, les modèles orthotopiques permettre étude des interactions cellulaires tumorales avec le microenvironnement du pancréas. La cinétique de la progression de la maladie sont très reproductibles dans les modèles orthotopiques et se produisent sur une courte période de temps (semaines), ce qui les rend bien adaptés aux tests pré-cliniques de nouveaux traitements. Ceci est en contraste avec les modèles transgéniques où l'apparition de la maladie se fait sur ​​une période plus longue et plus variable (mois à 1 an). ¹⁰ Lorsqu'il est utilisé avec des lignées cellulaires les plus agressifs, les modèles orthotopiques de cancer du pancréas ont des modèles de métastase spontanée similaires à ceux observés dans les patients. ⁸ Expression des gènes rapporteurs bioluminescents tels que la luciférase de luciole facilite le suivi longitudinal de la croissance tumorale, la dissémination métastatique, la récurrence et la réponse à la thérapeutique ^6,11.

Nous décrivons ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas qui utilise Matrigel pour la livraison de la cellule localisée et en imagerie par bioluminescence in vivo pour la surveillance non invasive de la progression tumorale. Ce modèle orthotopique de cancer du pancréas permet des analyses non-invasives de progression de la maladie et de la réponse aux interventions thérapeutiques dans des modèles syngéniques ou xénogreffe.

Protocole

Le protocole étant démontrée est réalisée sous la direction et l'approbation du soin des animaux de l'institution de l'auteur et du comité de l'emploi. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation.

1. Transduction Cance lignées cellulaires

1. les cellules cancéreuses pancréatiques transduisent d'exprimer la luciférase comme décrit précédemment. ^12,13 Panc-1 et des lignées de cellules Capan-1 pancréatiques cancéreuses transduites avec la luciférase de luciole sont utilisés ici.

Note: la luciférase de Renilla ou la luciférase bactérienne peuvent également être utilisés.

2. Préparation des cellules du cancer du pancréas

1. Culture transduction des cellules cancéreuses pancréatiques jusqu'à 70% de confluence.
2. Soulever les cellules pancréatiques et assurer la viabilité est supérieure à 90%.
3. Remettre en suspension à 2 x 10 ⁷ cellules / ml dans un mélange 3:2 Matrigel réfrigéré: Phosphate Buffered saline (PBS).
4. Conserver la suspension cellulaire sur Matrigel-glace avant l'injection dans le pancréas.

Notes: Pour assurer la solidification rapide de Matrigel, réduire le volume de PBS pour tenir compte du volume du culot cellulaire. Poignée Matrigel en utilisant des instruments glacées et des seringues à tout moment pour empêcher la solidification avant l'injection. Le nombre de cellules proposé est un guide et ne doit être déterminé de manière empirique pour chaque lignée cellulaire.

3. Préparation de la souris

1. Anesthésier la souris à l'aide d'inhalation 2-3% d'isoflurane. Déterminer la profondeur de l'anesthésie par le manque de pédale réflexe à un pincement de l'orteil doux.
2. Appliquer du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation.
3. Placer la souris sur son dos sur un coussin chauffant ° C 37 et tourner doucement la souris pour soulever le côté gauche de l'abdomen.
4. Préparation de l'abdomen avec une solution de polyvidone iodée à 10%.

Notes: InjectabLe anesthésie peut être utilisé à la place de l'anesthésie par inhalation. Le jeûne pré-opératoire n'est pas nécessaire.

4. Laparotomie

1. Utilisation d'instruments chirurgicaux stériles faire une incision cm 1.5 dans la peau d'environ 1 cm latéral gauche de la ligne médiane.
2. Faire une incision cm 1,5 dans le muscle abdominal sous-jacent.
3. Localisez la rate à l'aide des pinces et retirez délicatement la rate de la cavité abdominale. Fixez le spleen le long d'un coton-tige stérile pour exposer le pancréas sous-jacent.
4. Localiser la queue du pancréas à côté de la rate.
5. L'utilisation d'un G 0,3 ml 29 seringue à insuline, injecter 20 ul de la suspension Matrigel cellules dans le pancréas.
6. Après l'injection, tenir la seringue dans le pancréas pendant 30-60 secondes jusqu'à ce que le Matrigel a solidifié. Cette étape importante qui réduit les fuites de cellule.
7. Inspectez le site d'injection afin de s'assurer qu'aucune fuite s'est produite.
8. Retour de la rate et le pancréas de la cavité abdominale.

Remarque: Prenez soin de ne pas percer la face dorsale du pancréas qui peut être mince.

5. Fermeture de la paroi abdominale

1. Fermer la musculature abdominale de souris avec un fil de suture tressé résorbable 4-0 avec une aiguille ronde en utilisant un point en continu.
2. Fermez la peau extérieure avec un monofilament non résorbable 6-0 suture avec une aiguille de coupe en utilisant un point en continu.
3. Débranchez la souris de l'anesthésique inhalé et injecté 0,05-0,1 mg / kg de buprénorphine sous-cutanée.
4. Laisser la souris pour récupérer dans sa cage placée sur une ° C coussin chauffant 37 avec accès libre à la nourriture et à l'eau. Si les souris montrent des signes de douleur comme se courber ou à mobilité réduite, la buprénorphine peut être donnée toutes les 12 heures pendant une période de 36 heures.
5. Après la guérison des plaies (7-10 jours), anesthésier la souris et enlever les sutures externes.

6. Suivi bioluminescentes de Canc du pancréaser Progression

1. Anesthésier la souris à l'aide d'inhalation isoflurane.
2. Injecter 150 mg / kg D-luciférine via veine de la queue.
3. Placez la souris dans le système d'imagerie par bioluminescence et de capturer des images en lumière blanche et bioluminescence comme décrit précédemment. ^14,15
4. Débranchez la souris de l'anesthésique par inhalation et lui permettre de se remettre dans sa cage.

Note: imagerie bioluminescente est non-invasive et peut être effectuée périodiquement pour étudier la cinétique de la croissance tumorale. Pour tumeur de l'image dans la queue du pancréas, il est important de mettre la souris sur le côté gauche, alors les points tumorales vers la caméra. Nous imager une fois par semaine avec la fréquence est augmentée jusqu'à trois fois par semaine avant le point limite expérimental utilisant un système d'imagerie Lumina II (Perkin-Elmer, ancien Caliper Life Sciences) exécutant le logiciel 4.3.1 Imaging Vivre avec binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, exposition de 1 - 60 sec (déterminé par le plus expOsure sans saturation des pixels).

Résultats

Cette méthode décrit un modèle orthotopique de cancer du pancréas en utilisant des procédures chirurgicales, y compris l'induction de l'anesthésie, la laparotomie, l'injection de cellules cancéreuses dans la fermeture Matrigel et abdominale (figure 1A). Les cellules injectées forment une bulle dans la surface du pancréas (figure 1B). la progression du cancer du pancréas peut être surveillé de manière non invasive en utilisant l'imagerie par biolumin...

Discussion

Nous décrivons ici un modèle orthotopique pour l'évaluation longitudinale du développement des tumeurs du pancréas et de la progression. Cinétique de croissance tumeur primaire sont reproductibles (figure 3) et peuvent être non invasive surveillé utilisant l'imagerie par bioluminescence de cellules de luciférase marqués, par exemple pour l'analyse de la réponse tumorale à de nouvelles thérapies anti-cancer du pancréas. Conformément à la maladie humaine, le modèle mo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913