דגם orthotopic bioluminescent של התקדמות סרטן הלבלב

Summary

הבנה משופרת של ביולוגיה של סרטן הלבלב היא צורך קריטי כדי לאפשר הפיתוח של אפשרויות טיפוליות טובות יותר לטיפול בסרטן הלבלב. כדי לענות על צורך זה, אנו מדגימים מודל orthotopic של סרטן הלבלב המאפשר ניטור בלתי פולשני של התקדמות הסרטן באמצעות In vivo הדמיה פליטת אור.

Abstract

Introduction

סרטן הלבלב הוא הגורם המוביל הרביעי של מוות הקשור לסרטן, עם שיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 4-6%. ^1,2 רק 15% מהחולים מאובחנים מוקדם מספיק במחלה כדי להיות זכאי לניתוח, וגידולים להישנות ב> 80% מהחולים הללו. ^3,4 Gemcitabine משמש לטיפול באדנוקרצינומה בלבלב, לעומת זאת, chemoresistance שכיח ולעתים קרובות יש לתרופת השפעה מועטת על הישרדות כוללת. ⁵ אסטרטגיות תרופתיות חדשות לטיפול בסרטן הלבלב יש צורך בביקורתיות. פיתוחם תלוי בהבנה השתפרה באופן משמעותי מהצעדים של התקדמות מחלה המרכזיים שעשויות להיות רגישה להתערבות טיפולית.

מודלים orthotopic של סרטן הלבלב לחקות היבטים מרכזיים של המחלות האנושית, מה שהופך אותם אידיאליים לכלי מחקר על הביולוגיה של סרטן הלבלב. ^6-9 בניגוד למבחנים במבחנה של התנהגות תא סרטן הלבלב מבוססי תאיםד תת עורית במודלי vivo של סרטן הלבלב, מודלים orthotopic לאפשר חקירה של אינטראקציות תא סרטניים עם microenvironment הלבלב. קינטיקה של התקדמות מחלה הן מאוד לשחזור בדגמי orthotopic ומתרחש על מסגרת זמן קצרה (שבועות), מה שהופך אותם מתאימים היטב לבדיקות טרום קליניות של תרופות חדשות. זאת בניגוד למודלים מהונדסים שבו התפרצות מחלה מתרחשת על פני פרק זמן ארוך יותר ומשתנה יותר (חודשים עד 1 שנה). ^-10 כאשר בשימוש עם שורות תאים יותר אגרסיביות, יש לי דגמי orthotopic של סרטן לבלב דפוסי גרורות ספונטניות דומים לאלה שראו ב חולים. ⁸ ביטוי של גני כתב bioluminescent כמו הגחלילית לוציפראז מאפשר ניטור האורך של גידול, הפצה גרורתי, הישנות ותגובה לתרופות. ^6,11

כאן אנו מתארים מודל orthotopic של סרטן הלבלב אשר מנצל MatrIgel למסירת תא מקומי ובהדמית פליטת אור vivo לניטור בלתי פולשני של התקדמות גידול. מודל orthotopic זה של סרטן הלבלב מאפשר ניתוחים לא פולשנית של התקדמות מחלה ותגובה להתערבויות טיפוליות במודלי syngenic או xenograft.

Protocol

הפרוטוקול שמפגינים מבוצע תחת הדרכתו ואישורו של הטיפול בבעלי החיים של המוסד של המחבר ועדת שימוש. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים.

1. Transducing שורות תאי סרטן הלבלב

1. תאי סרטן לבלב transduce להביע לוציפראז כפי שתוארו לעיל. ^12,13 PANC-1 ו-1 Capan שורות תאי סרטן לבלב transduced עם הגחלילית לוציפראז משמשים כאן.

הערה: עשוי לשמש גם לוציפראז Renilla או לוציפראז חיידקים.

2. הכנת תא סרטן הלבלב

1. תרבות transduced תאי סרטן לבלב עד 70% ומחוברות.
2. הרם את תאי הלבלב ולהבטיח את יכולת הקיום היא יותר מ -90%.
3. Resuspend ב2 תאי x 10 ⁷ / מ"ל בתערובת של Matrigel 03:02 הצונן: פוספט שנאגרו סאלine (PBS).
4. שמור על ההשעיה Matrigel התאים על קרח לפני ההזרקה לתוך הלבלב.

הערות: כדי להבטיח התמצקות מהירה של Matrigel, להפחית את עוצמת קול PBS כדי להסביר את עוצמת הקול של גלולה התא. ידית Matrigel באמצעות מכשירים ומזרקים קרים כקרח בכל העת כדי למנוע התמצקות לפני הזריקה. מספר התא הציע הוא מדריך וצריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל שורת תאים.

3. הכנת עכבר

1. להרדים את העכבר באמצעות שאיפת 2-3% isoflurane. לקבוע עומק ההרדמה על ידי חוסר הדוושה רפלקס לקמצוץ הבוהן עדין.
2. החל סיכה לעיניים, כדי למנוע התייבשות.
3. מקם את העכבר על גבה על 37 מעלות צלזיוס וכרית חימום בעדינות להפוך להעלות את הצד השמאלי של בטן העכבר.
4. הכן את הבטן עם תמיסת יוד povidone 10%.

הערות: Injectabהרדמה le עשויה לשמש במקום הרדמה נשאפת. הצום טרום ניתוח לא הכרחי.

4. Laparotomy

1. שימוש במכשירי ניתוח סטריליים לעשות חתך 1.5 ס"מ בעור כ 1 ס"מ לרוחב משמאל לקו האמצע.
2. ביצוע חתך 1.5 ס"מ בשריר הבטן הבסיסי.
3. אתר את הטחול באמצעות המלקחיים ולהסיר בעדינות את הטחול מחלל הבטן. אבטח את הטחול יחד קלון צמר גפן סטרילי כדי לחשוף את הלבלב הבסיסי.
4. אתר את הזנב של הלבלב בסמוך לטחול.
5. באמצעות מזרק אינסולין G 0.3 מ"ל 29, להזריק 20 μl של ההשעיה Matrigel התאים ללבלב.
6. בעקבות הזרקה, מחזיק את המזרק בלבלב במשך 30-60 שניות, עד Matrigel יש הקרושה. צעד חשוב זה ממזער זליגת תא.
7. בדוק את האתר של הזרקה כדי להבטיח שאין דליפה התרחשה.
8. להחזיר את הטחול והלבלב לחלל הבטן.

שים לב: שמור על עצמך כדי למנוע ניקוב צד הגב של הלבלב שעלולה להיות רזה.

5. סגירת דופן בטן

1. סגור את שרירי הבטן של העכבר עם תפר 4-0 קלוע נספג במחט סיבוב באמצעות תפר מתמשך.
2. סגור את העור החיצוני עם תפר 6-0 חוט חד שאינם נספג במחט חיתוך באמצעות תפר מתמשך.
3. הסר את העכבר מחומר ההרדמה בשאיפה והזריקו עצירות 0.05-0.1 מ"ג / ק"ג תת עורי.
4. אפשר העכבר כדי להתאושש בכלוב שלה מונח על 37 מעלות צלזיוס עם כרית חימום גישה החופשית למזון ומים. אם עכברים מראים סימנים של כאב כגון קמר או ניידות מוגבלת, יכולים להינתן עצירות כל שעה 12 על פני תקופה שעות 36.
5. לאחר ריפוי פצע (7-10 ימים), להרדים את העכבר ולהסיר את התפרים החיצוניים.

6. מעקב bioluminescent של canc הלבלבהתקדמות ER

1. להרדים את העכבר באמצעות שאיפת isoflurane.
2. להזריק 150 מ"ג / ק"ג D-luciferin דרך וריד זנב.
3. מניחים את העכבר במערכת ההדמיה bioluminescent וללכוד לבן אור ופליטת אור תמונות כפי שתואר לעיל. ^14,15
4. הסר את העכבר מחומר ההרדמה בשאיפה ולאפשר לו להתאושש בכלוב בביתה.

הערה: ההדמיה Bioluminescent אינה פולשני וניתן לבצע מעת לעת כדי לחקור קינטיקה צמיחת גידול. לגידול תמונה בזנב הלבלב שזה חשוב לשים את העכבר בצד השמאל שלה, ולכן את הנקודות הסרטניים לכיוון המצלמה. אנחנו צילמו פעם בשבוע עם התדירות מוגברת עד שלוש פעמים בשבוע לפני נקודת סיום הניסוי באמצעות ומינה השנייה הדמיה מערכת (פרקין אלמר, לשעבר Caliper מדעי חיים) פועלת תוכנת 4.3.1 הדמיה לחיות עם 4 binning, FOV 12.5, F-stop 1, חשיפה 1-60 שניות (שנקבע על ידי Exp הגבוה ביותרosure בלי הרוויה פיקסל).

תוצאות

שיטה זו מתארת ​​מודל orthotopic של סרטן הלבלב באמצעות הליכים כירורגיים, כולל אינדוקציה של הרדמה, laparotomy, הזרקה של תאים סרטניים ובסגירת Matrigel בטן (איור 1 א). את התאים המוזרקים בצורת בועה בשטח של הלבלב (איור 1). התקדמות סרטן הלבלב עשויה להיות הלא פולשני בפיק?...

Discussion

כאן אנו מתארים מודל orthotopic להערכת אורך של התפתחות גידולי לבלב והתקדמות. קינטיקה צמיחת גידול הראשונית הן שחזור (איור 3) ועשויה להיות הלא פולשני פיקוח באמצעות הדמיה פליטת אור של תאי לוציפראז-מתויגים, לדוגמה, עבור ניתוחים של תגובת גידול לתרופות לסרטן לבלב א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913