Pankreas Kanseri İlerleme Bioluminescent Ortotopik Model

Özet

Pankreas kanseri biyoloji Geliştirilmiş anlayış eleştirel pankreas kanseri tedavisi için daha iyi tedavi seçeneklerinin gelişimi için gereklidir. Bu ihtiyacı karşılamak için, bizim kullandığımız kanser ilerlemesi non-invazif izleme izin pankreas kanseri ortotopik modeli göstermek In vivo Biyoparlaklık görüntüleme.

Özet

Giriş

Pankreas kanseri% 4-6 bir 5-yıllık sağkalım oranı ile, kansere bağlı ölüm dördüncü önde gelen nedenidir. Hastaların ^1,2 sadece 15% cerrahi için uygun olduğu hastalığı zamanında teşhis ve tümörler tekrarlayabilir edilir > bu hastaların% 80'inde. ^3,4 Gemsitabin pankreas adenokanserlerinin tedavisinde kullanılan, ancak, kemoterapi yaygındır ve genellikle ilaç genel sağkalım üzerinde çok az etkisi vardır. pankreas kanseri tedavisi için ⁵ Yeni farmakolojik stratejiler kritik ihtiyaç vardır. Onların gelişimi terapötik müdahale duyarlı olabilir hastalığın ilerlemesi en önemli adımlardan önemli ölçüde geliştirilmiş anlayış bağlıdır.

Pankreas kanseri ortotopik modelleri pankreas kanseri biyoloji eğitim için ideal alet yapımında, insan hastalığın temel yönlerini taklit. Pankreas kanseri hücre davranış in vitro hücre tabanlı deneyleri aksine bir olarak ^6-9pankreas kanseri in vivo modellerde d deri altı, ortotopik modelleri pankreas mikro ile tümör hücre etkileşimlerinin incelenmesi sağlar. Hastalığın ilerlemesi kinetik ortotopik modelleri son derece tekrarlanabilir ve onları da yeni tedavi öncesi klinik test için uygun hale getirir kısa bir süre (hafta), üzerinde meydana gelir. Bu hastalık başlangıcı daha uzun ve daha değişken bir zaman dilimi (ay 1 yıl). ¹⁰ daha agresif hücre hatları ile kullanılan gerçekleşir transgenik modelleri aksine olan, pankreas kanseri ortotopik modellerinde görülen benzer spontan metastaz desenler var hasta. gibi ateşböceği lusiferaz gibi bioluminescent muhabiri genlerin ⁸ İfade tümör büyümesinin boyuna izlenmesi, metastatik yayılması, nüks ve tedavi yanıt kolaylaştırır. ^6,11

Burada Matr kullanır pankreas kanseri ortotopik modeli tariftümör progresyonu non-invazif izleme için lokalize hücre teslimat ve in vivo biyoparlaklık görüntüleme için igel. Pankreas kanseri Bu ortotopik modeli hastalığın ilerlemesi ve syngenic veya xenograft modellerinde tedavi girişimlerine yanıt non-invaziv analiz sağlar.

Protokol

Gösterdi olan Protokol yazarın kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür.

1. Pankreas Kanseri Hücre Hatları iletici

1. Daha önce tarif edildiği gibi transdüksiyonu pankreas kanseri hücrelerinin lusiferaz ifade etmek. ^12,13 Panc-1 ve Capan-1 pankreas kanseri hücre hatlarının ateşböceği lusiferaz ile transduse burada da kullanılmıştır.

Not: Renilla lusiferaz ve bakteriyel lusiferaz da kullanılabilir.

2. Pankreas Kanseri Hücre Hazırlık

1. Kültür% 70 konfluent kadar pankreas kanseri hücrelerinin transduse.
2. Pankreas hücreleri kaldırın ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun.
3. Matrigel soğutulmuş, 3:2 karışımı içinde 2 x 10 ⁷ hücre / ml 'de yeniden süspanse: Fosfat tamponlu tuzine (PBS).
4. Önce pankreas içine enjeksiyon için buz üzerinde Matrigel-hücre süspansiyonu tutun.

Notlar: Matrigel hızlı katılaşma sağlamak için, hücre pelet hacmi hesaba PBS hacmini azaltmak. Enjeksiyondan önce katılaşma önlemek için her zaman buz gibi araçlar ve şırınga kullanarak Matrigel tutun. Önerilen hücre sayısı bir kılavuzdur ve her bir hücre hattı için ampirik olarak belirlenmelidir.

3. Fare Hazırlık

1. % 2-3 izofluran teneffüs kullanarak fare anestezisi. Hafif bir ayak tutam için pedal refleks eksikliğinden anestezi derinliği belirler.
2. Kuruma önlemek için gözleri bir miktar gres sürülmesi.
3. 37 ° C ısıtma yastığı sırtında fare yerleştirin ve yavaşça karın sol tarafında yükseltmek için fareyi açın.
4. % 10 povidon iyot çözeltisi ile karın hazırlayın.

Notlar: Injectable anestezi inhale anestezi yerine kullanılabilir. Ameliyat öncesi açlık gerekli değildir.

4. Laparotomi

1. Steril cerrahi aletler kullanarak yaklaşık 1 cm orta hat yanal sol deride 1.5 cm kesi yapmak.
2. Temel karın kas bir 1.5 cm kesi olun.
3. Forseps kullanarak dalak bulun ve yavaşça karın boşluğundan dalak çıkarın. Altta yatan pankreas ortaya çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk boyunca dalak sabitleyin.
4. Dalak bitişik pankreas kuyruk bulun.
5. Bir 29 g, 0.3 ml insülin şırınga kullanarak, pankreas içine Matrigel hücre süspansiyonu, 20 ul enjekte edilir.
6. Matrigel katılaşmış kadar enjeksiyonu takiben, 30-60 saniye pankreas şırınga tutun. Bu önemli bir adım hücre kaçağı en aza indirir.
7. Herhangi bir sızıntı meydana sağlamak için enjeksiyon yerinde kontrol edin.
8. Karın boşluğuna dalak ve pankreas dönün.

Not: ince olabilir pankreas sırt tarafında delinmesiyle önlemek için dikkat edin.

5. Karın Duvarı Kapatma

1. Sürekli bir dikiş kullanarak bir yuvarlak iğne ile emilebilir örgülü 4-0 sütür ile fare karın kas kapatın.
2. Sürekli bir dikiş kullanarak bir kesici iğne ile bir emilmeyen monofilament 6-0 sütür ile dış deri kapatın.
3. Inhale anestezik ve deri altına enjekte 0.05-0.1 mg / kg buprenorfin gelen fareyi çıkarın.
4. Fare yiyecek ve su ücretsiz erişim ile 37 ° C ısıtma yastığı yerleştirilir kafesine kurtarmak için izin verin. Farenin bu hunching veya azalan hareketlilik gibi ağrı belirtileri gösteriyorsa, buprenorfin, bir 36 saat süre boyunca her 12 saat verilebilir.
5. Yara iyileşmesi (7-10 gün) sonra, fare uyutmak ve dış dikişler çıkarın.

6. Pankreas Canc bir Bioluminescent İzlemeer ilerleme

1. Izofluran teneffüs kullanarak fare anestezisi.
2. Kuyruk ven yoluyla 150 mg / kg D-luciferase enjekte edilir.
3. Bioluminescent görüntüleme sisteminde fare yerleştirin ve daha önce açıklandığı gibi beyaz ışık ve biyolüminesans görüntüleri yakalayabilir. ^14,15
4. Inhale anestezik gelen fareyi çıkarın ve onun evde kafes içinde kurtarmak için izin verir.

Not: Bioluminescent görüntüleme non-invaziv ve tümör büyüme kinetiği araştırmak için periyodik olarak yapılabilir. Pankreas kuyruk görüntü tümör için onun sol tarafında fare koymak önemlidir, kameraya doğru tümör noktaları çok. Frekans önce FOV 12.5 binning 4 Oturma Görüntüleme 4.3.1 yazılımı çalıştıran bir Lumina II görüntüleme sistemi (Perkin-Elmer, eski Kaliper Yaşam Bilimleri), kullanarak deneysel nokta için haftada üç katına kadar artırılabilir ile Biz, haftada bir kez görüntülendi F-stop 1, pozlama 1 - 60 saniye (en yüksek exp tarafından belirlenirpiksel doygunluk olmadan osure).

Sonuçlar

Bu yöntem, anestezi indüksiyonu, laparotomi, Matrigel ve karın kapatılması (Şekil 1A) kanser hücrelerinin enjeksiyonu da dahil olmak üzere cerrahi işlemler, kullanarak pankreas kanseri ortotopik model tanımlamaktadır. Enjekte edilen hücreler, pankreas yüzeyinde bir balon (Şekil 1B) oluşturur. Pankreas kanseri ilerleme non-invaziv kanser hücre çoğalması ve yayılması (Şekil 2) izlemek için in vivo biyolüminesans görüntüleme kul...

Tartışmalar

Burada pankreas tümör gelişimi ve ilerlemesi boyuna değerlendirilmesi için ortotopik modeli tarif. Primer tümör büyüme kinetiği tekrarlanabilir (Şekil 3) ve yeni anti-pankreas kanseri tedavi tümör yanıtı analizleri için örneğin lusiferaz-etiketli hücreleri biyoparlaklık görüntüleme kullanarak non-invaziv takip olabilir. , Insan hastalığı ile uyumlu olarak, model pankreas mikro tümör hücre etkileşimleri inceleme sağlayan yerel pankreas invazyonu (Şekil 4A)...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913