Биолюминесцентный Ортотопическая Модель прогрессировании рака поджелудочной железы

Резюме

Лучшее понимание биологии рака поджелудочной железы крайне необходимо для того, чтобы развитие лучших терапевтические возможности для лечения рака поджелудочной железы. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы демонстрируем ортотопической модели рака поджелудочной железы, который позволяет неинвазивного мониторинга прогрессирования рака использования В естественных условиях Биолюминесценции изображений.

Аннотация

Введение

Рак поджелудочной железы является четвертой ведущей причиной онкологической смертности, связанной, с 5-летняя выживаемость составляет 4-6%. ^1,2 Только 15% больных диагностируются достаточно рано в болезни, чтобы иметь право на операцию, и опухоли повториться в> 80% пациентов. ^3,4 Гемцитабина используется для лечения рака поджелудочной аденокарциномы, однако, устойчивость к химическому воздействию является общим и часто препарат оказывает незначительное влияние на общую выживаемость. ⁵ новых фармакологических стратегий для лечения рака поджелудочной железы критически необходимы. Их развитие зависит от значительно улучшили понимание ключевых шагов прогрессирования заболевания, которые могут быть чувствительны к терапевтическому вмешательству.

Ортотопическая модели рака поджелудочной железы подражать ключевые аспекты болезней человека, что делает их идеальным инструментом для изучения биологии рака поджелудочной железы. ^6-9 В отличие от в пробирке на основе клеток поджелудочной поведение раковых клетокD подкожной в естественных условиях модели рака поджелудочной железы, ортотопический модели позволяют исследование опухоли взаимодействия клетки с поджелудочной микросреды. Кинетика прогрессирования заболевания являются высокая воспроизводимость в ортотопический моделей и происходят в течение короткого промежутка времени (недели), что делает их хорошо подходит для доклинических испытаний терапии романа. Это в отличие от трансгенных моделей, в которых начало заболевания происходит в течение более длительного и более переменных времени кадра (месяцев до 1 года). ¹⁰ При использовании с более агрессивными клеточных линий, ортотопической модели рака поджелудочной железы у модели спонтанной метастазов аналогичны тем, которые наблюдаются при пациентов. ⁸ Выражение биолюминесцентного репортерных генов, таких как люциферазы светлячка облегчает продольной мониторинга роста опухоли, метастазирование, рецидив и ответ терапии. ^6,11

Здесь мы опишем ортотопической рак поджелудочной железы, который использует MatrИгель для локализованной доставки клетке и в естественных изображений биолюминесценции для неинвазивного мониторинга прогрессирования опухоли. Это ортотопический модели рака поджелудочной железы позволяет неинвазивные анализы прогрессирования заболевания и ответ на терапевтические вмешательства в сингенные или ксенотрансплантатом моделей.

протокол

Протокол демонстрируются осуществляется под руководством и утверждения учреждения автора уходу и использованию животных комитета. Все эксперименты выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.

1. Трансдуцирующих поджелудочной клеточных линиях рака

1. Трансдукции клетки поджелудочной железы выразить люциферазы, как описано выше. ^12,13 Panc-1 и Capan-1 панкреатических раковых клеточных линий, трансдуцированных люциферазы светлячка не используются.

Примечание: люциферазы Renilla или бактериальной люциферазы также могут быть использованы.

2. Клеток рака поджелудочной железы подготовка

1. Культура не трансдуцированных клеток рака поджелудочной железы до 70% вырожденная.
2. Лифт клеток поджелудочной железы и обеспечить жизнеспособность превышает 90%.
3. Ресуспендируют в 2 × 10 ⁷ клеток / мл в смеси 3:2 охлажденной Матригель: фосфатным буфером салине (PBS).
4. Держите матригелем клеточной суспензии на льду до инъекции в поджелудочной железе.

Примечание: Для обеспечения быстрого затвердевания матригеля, уменьшите громкость PBS для учета объема осадок клеток. Ручка Матригель использованием ледяной инструменты и шприцы в любое время, чтобы предотвратить затвердевание перед инъекцией. Предложенные сотового телефона представляет собой руководство и определяется опытным путем для каждой клеточной линии.

3. Подготовка Мышь

1. Обезболить мыши ингаляций 2-3% изофлурана. Определите глубину анестезии из-за отсутствия педали рефлекс на нежный щепотку ног.
2. Нанесите смазку на глаз, чтобы предотвратить высыхание.
3. Поместите мышь на спине на 37 ° грелку C и осторожно повернуть мышь, чтобы поднимать с левой стороны живота.
4. Подготовьте живота с 10%-ным раствором йода повидон.

Примечания: Injectabле анестезии может быть использован вместо ингаляционных анестезии. Предоперационная подготовка натощак не нужно.

4. Лапаротомия

1. Использование стерильных хирургических инструментов сделать 1,5 см разрез в коже приблизительно в 1 см от левой боковой линии.
2. Сделайте 1,5 см разрез в базовой брюшной мышцы.
3. Найдите селезенки помощью щипцов и аккуратно удалить селезенку из брюшной полости. Закрепите селезенки по стерильным ватным тампоном, обнажив расположенную внизу поджелудочной железы.
4. Местонахождение хвоста поджелудочной железы, прилегающих к селезенке.
5. С помощью 29 G 0,3 мл шприц инсулина, вводят 20 мкл Матригель клеточной суспензии в поджелудочной железе.
6. После инъекции Держите шприц в поджелудочной железе в течение 30-60 сек, пока Матригель не затвердеет. Этот важный шаг ячейки минимизирует утечку.
7. Осмотр в месте инъекции, чтобы исключить утечки не наблюдалось.
8. Возврат селезенки и поджелудочной железы в брюшную полость.

Внимание: Будьте внимательны, чтобы избежать проколов спинной стороны поджелудочной железы, которые могут быть тонкими.

5. Брюшной стенки пробки

1. Закрыть брюшную мускулатуру мышь с рассасывающиеся плетеные 4-0 шва с круглой иглой с использованием непрерывного шва.
2. Закрыть внешней обшивки с нерассасывающихся мононити 6-0 шва с режущей иглой с использованием непрерывного шва.
3. Отключив мышь от вдыхаемого анестезией и вводят внутривенно 0,05-0,1 мг / кг подкожно бупренорфин.
4. Разрешить мышь, чтобы восстановить в клетке помещают на 37 ° C грелку со свободным доступом к пище и воде. Если мышей демонстрировать признаки боли, такие как скрючившись или ограниченной подвижностью, бупренорфин может быть дано каждые 12 часа в течение периода 36 час.
5. После заживления раны (7-10 дней), анестезию мыши и удаления внешнего швов.

6. Биолюминесцентный Tracking поджелудочной CancER прогрессии

1. Обезболить мыши с помощью вдыхания изофлурана.
2. Введите 150 мг / кг D-люциферином через хвостовую вену.
3. Наведите в биолюминесцентными системы визуализации и захвата белого света и изображений биолюминесценции как описано выше. ^14,15
4. Отключив мышь от ингаляционных анестетиков и дать ему восстановиться в своем доме клетку.

Примечание: Биолюминесцентный изображений является неинвазивным и может проводиться периодически исследовать опухоли кинетики роста. Чтобы изображение опухоли в поджелудочной хвост важно поставить мыши на его левой стороне, так опухоли указывает на камере. Мы отображаемого один раз в неделю с частотой увеличена до трех раз в неделю до экспериментальных конечную точку, используя Lumina II изображений (Perkin-Elmer, ранее суппорт Life Sciences) работает гостиная программного обеспечения 4.3.1 Формирование изображений с помощью биннинге 4, угол обзора 12,5, F-стоп 1, выдержка 1 - 60 сек (определяется по наибольшему Exposure без пиксельных насыщенность).

Результаты

Этот метод описывает ортотопической рака поджелудочной железы с помощью хирургического вмешательства, в том числе индукции анестезии, лапаротомия, инъекции раковых клеток в Матригель и брюшной закрытия (рис. 1А). Вводили клетки образуют пузырей на поверхности поджелудочной ж...

Обсуждение

Здесь мы опишем ортотопической для продольного оценки развития поджелудочной железы и прогрессию опухолей. Первичная опухоль кинетики роста воспроизводимые (рис. 3) и может быть неинвазивно контролировать с помощью биолюминесценции люциферазы изображений с метками клетках,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913