JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا المقال فيديو مجموعة المتابعة، والإجراءات اللازمة لتصحيح أجسام الخلايا وكيفية تنفيذ تسجيلات المشبك الحيوية من خلايا العقدة في جبل لالجامع الماوس للشبكية. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في مساهمة الدقيق للمدخلات متشابك مثير والمثبطة، وحجمها النسبي وتوقيت لالتشويك العصبية.

Abstract

خلايا العقدة هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين ويعكس نشاطهم دمج مدخلات متشابك المتعددة التي تنشأ من الدوائر العصبية المحددة. تقنيات المشبك التصحيح، المشبك في الجهد وتكوينات الشبك الحالية، وتستخدم عادة لدراسة الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية لتوصيف ومدخلاتها متشابك. على الرغم من أن تطبيق هذه التقنيات هو غنية بالمعلومات، فإنها تشكل القيود المختلفة. على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد كيفية التفاعل الدقيق للمدخلات مثير والمثبطة تحديد الانتاج استجابة. لمعالجة هذه المسألة، استخدمنا تقنية تعديل الحالي المشبك، المشبك دينامية، وتسمى أيضا تصرف المشبك 1، 2، 3 ودرست تأثير المدخلات متشابك مثير والمثبطة على استثارة الخلايا العصبية. هذا الأسلوب يتطلب حقن التيار في الخلية وتعتمد على ردود الفعل في الوقت الحقيقي من غشاء المحتملة لها في ذلك الوقت. وinjecteيتم احتساب د الحالي من المواصلة محددة سلفا متشابك مثير والمثبطة، إمكانات انعكاس وإمكاناتهم الخلية غشاء حظية. ، ويوضح التفاصيل بشأن إجراءات تجريبية التصحيح لقط الخلايا لتحقيق تكوين خلية كاملة وتوظيف تقنية المشبك دينامية في هذه المقالة الفيديو. هنا، نقدم لك مجموعة من الردود من خلايا الشبكية العقدة الماوس لمختلف الطول الموجي تصرف تم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم أو في وجود مخدرات. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من استخدام المواصلة مثير والمثبطة اصطناعية تم إنشاؤها باستخدام وظائف ألفا للتحقيق في استجابات الخلايا.

Introduction

شبكية العين هي الأنسجة العصبية شبه شفافة بطانة الجزء الخلفي من العين. العديد من الدراسات استخدام شبكية العين كنموذج للتحقيق الخطوات الأولى في المعالجة البصرية وآليات إشارات متشابك. منذ الشبكة الشبكية في إعداد كامل جبل لا يزال سليما بعد تشريح، لأنها تمثل نظام مثالي لدراسة التفاعلات متشابك كما ردودها الفسيولوجية هي مشابهة جدا لفي ظروف فيفو. وهكذا، وذلك باستخدام شبكية العين معزولة يمكن دراسة خصائص الخلايا العصبية وذلك باستخدام تقنيات المشبك التصحيح (على الاستعراضات على هذه التقنية، نرى 6،9،13). تحديد مساهمة الدقيق للدوائر والناقلات العصبية إلى استجابة الخلايا العقدية المحددة، ومع ذلك، وعادة ما أعاق وكلاء الدوائية تعمل في مواقع مختلفة.

يمكن تسجيل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية في شبكية العين للضوء، والتحفيز الطبيعي، مع ماصات زجاجية مملوءة السوائل داخل الخلايا. باستخدام معدل التصحيحيمكن تسجيل تقنيات أمبير، والاستجابات العصبية لتحفيز الضوء عن التقلبات المحتملة غشاء (الشبك الحالية) أو كما التيارات (المشبك الجهد). من خلال عقد غشاء المحتملة في مختلف الجهود وتنفيذ تحليل تصرف اللاحق، فمن الممكن لعزل المدخلات متشابك المثبطة ومثير 5،12. هذا النوع من التجارب يمكن القيام بها في المتوسطة الاستحمام العادي وبحضور وكلاء الدوائية المختلفة لعزل مساهمة الناقلات العصبية والمستقبلات العصبية إلى استجابات مختلفة. هناك ثروة من الدراسات من العديد من المختبرات تتميز اعتماد ارتفاعه الانتاج والمدخلات مثير والمثبطة على خصائص التحفيز مثل حجم، وعلى النقيض، الترددات المكانية والزمانية، والتوجيه، والتوجيه والتحفيز المتغيرات الأخرى. على الرغم من أن هذه المناهج التجريبية تقديم معلومات عن العلاقة بين المخرجات والمدخلات ارتفاع متشابك بوصفها وظيفة من خصائص التحفيز،تفسير مساهمة أنواع معينة من الخلايا ومدخلاتها متشابك إلى استثارة الخلايا ليست واضحة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن المدخلات عادة كل مثير والمثبطة تختلف مع خصائص التحفيز وبالتالي، فإنه ليس من الممكن تقييم التأثير الدقيق أن التغيرات في أي من هذه المدخلات له على التشويك العصبية هذه.

نهج بديل للتحايل على هذه القيود هو القيام تسجيلات المشبك الحيوية، والتي تسمح اجراء تقييم نقدي للمساهمة مدخلات متشابك الفردية إلى ارتفاعه الإخراج. تقنية المشبك دينامية يسمح الحقن المباشر للتيار في الخلية وكمية حقن الحالية في وقت معين يعتمد على غشاء المحتملة سجلت في ذلك الوقت 1،2،3 (للمراجعة، انظر 7،14). بل هو الشبك الحالية المعدلة انشاء حيث في الوقت الحقيقي، والتفاعل ردود فعل سريعة بين الخلية تحت تسجيل والمعدات التي تضم الأجهزة المتخصصة، والبرمجياتويتم التوصل إلى جهاز الكمبيوتر. يتم احتساب مبلغ حقن الحالي في الخلية وفقا لذلك. وبالتالي، فإن ميزة هذا الأسلوب هو أن الخلية يمكن حفز مع مجموعات مختلفة من الطول الموجي تصرف، وسوف ردها تحاكي تنشيط مستقبلات التي تتوسط المدخلات متشابك. على سبيل المثال، مقارنة الاستجابة لحقن المواصلة مثير والمثبطة لبقعة صغيرة مع الاستجابة لحقن تصرف مثير للبقعة صغيرة فقط يوفر معلومات عن تأثير تثبيط على استجابة الخلية. وبالمثل، تركيبات أخرى من المواصلة سجلت الناحية الفسيولوجية يمكن أن يشترك في حقن للكشف عن كيفية التي تعتمد على التحفيز التغييرات في المواصلة مثير و / أو المثبطة تؤثر على انتاج مسمار.

في دراستنا، يتم استخدام تقنية المشبك دينامية للتدليل على أثر السعة وتوقيت مدخلات متشابك على خصائص اطلاق النار من خلايا الشبكية العقدة النسبية. المواصلة مختلفتم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم أو في وجود وكلاء الدوائية كانوا يعملون كمدخلات. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت المواصلة الاصطناعي على أساس وظائف ألفا أيضا من أجل التحقيق في كيفية إدماج المدخلات متشابك من قبل الخلايا العصبية. وبالتالي هذا هو أسلوب متعدد الاستعمالات التي تسمح أنواع مختلفة من تصرف ولدت إما من الناحية الفسيولوجية، ليتم حقنه دوائيا أو حسابيا في نفس الخلايا العقدية، ويمكن إجراء مقارنة ذلك من الاستجابات لهذه المدخلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تعيين ما يصل العامة وتحضير الأنسجة

  1. الحفاظ على الماوس في الظلام لمدة 30 دقيقة (تهدف إلى تقليل مستوى الإجهاد بها). في الوقت الذي تنتظر، وإعداد 1 لتر من حل خارج الخلية. أول حل 1.9 غرام من بيكربونات الصوديوم في نصف لتر من الماء ملي-Q. يتم الحفاظ على درجة الحموضة له عند 7.4 بواسطة محتدما مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. بعد خمس دقائق، ويحل 8.8 غرام من أميس متوسطة في 100 مل من الماء ملي-Q، إضافة إلى حل بيكربونات الصوديوم، وأعلى ما يصل إلى 1 L مع الماء ملي-Q وتخلط جيدا. إبقاء هذا الحل carboxygenated لبقية التجربة.
  2. خذ 250 مل من carboxygenated أميس متوسطة وإعداد نظام ضخه السوائل في الكهربية انشاء. الحفاظ على حل carboxygenated.
  3. بشكل موحد مسحة طبقة رقيقة من الشحوم فراغ على الجزء السفلي من غرفة نضح. ختم ذلك مع انزلاق الغطاء والتأكد من أنها غير محكمة الغلق. تأخذ كمية صغيرة من الشحوم (~ 2 مم في القطر) ووضعه على رأس وينتهي الجزء السفلي من الغرفة. وهذه الكرات عقد الشبكة (الإطار البلاتين موتر مع خيط تنظيف الأسنان) في المكان ومنعها الضغط من الصعب جدا على شبكية العين. إصلاح الدائرة على منصة ومحاذاة كلا فتحات.
  4. هذا الحيوان هو أول مخدرة مع isoflurane ولمدة 2 دقيقة، ثم التضحية من قبل خلع عنق الرحم. بسرعة إزالة العيون مع زوج من مقص صغير (ريش المنحني)، ويغسل جيدا مع السائل خارج الخلية carboxygenated في كوب صغير، ثم وضع في طبق بتري مليئة بسائل خارج الخلية carboxygenated.
  5. تحت المجهر تشريح، وجعل ثقب الإدراج في القرنية (~ 2 مم من الحافة) باستخدام إبرة قياس 19. تكرار للعين الأخرى. هذه خطوة مهمة يجب أن تكون سريعة لتسمح الأوكسجين في كلا الشبكية. إزالة القرنية واحد مع زوج من مقص القزحية الصغيرة عن طريق خفض مواز لحافته. المقبل، وإزالة القزحية والعدسة مع زوج من ملقط غرامة. تكرار للعين الأخرى. نقل كوب واحد العين في دورق يحتوي علىcarboxygenated حل خارج الخلية.
  6. مع شفرة مشرط، وقطع كوب واحد العين في نصف، لتكون قادرة على تسطيح كل جبل والحصول على اثنين من كامل يتصاعد في شبكية العين. فصل بعناية الشبكية من الظهارة الصبغية باستخدام مسبار تشريح حادة أو عن طريق سحب بلطف تشغيله. مرة واحدة منفصلة، ​​وشبكية العين هي شفافة إلى حد ما. ملاحظة سطح محدب هو الجانب مبصرات. سطح مقعر هي خلايا العقدة الجانب وأنه قد عصا لنفسها بسبب وجود النكتة زجاجي مثبت.
  7. مع زوج من ملقط غرامة، مع الاستمرار على حافة منفصلة إغلاق أنسجة الشبكية إلى مشرشر ORA والاستيلاء على مشرشر ORA مع زوج آخر من ملقط غرامة، تسحبه نحو مركز شبكية العين. هذه عملية حساسة وقد يستغرق بضعة محاولات. في حال نجاحها، تتم إزالة مشرشر ORA، الجسم الهدبي والفكاهة زجاجي من قبل هذه العملية، ويتم تقليل انحناء شبكية العين (أي تملق).
  8. تقليم الحواف، ومن ثم نقلها إلى نصيبغرفة الانصهار مع خلايا العقدة مواجهة. عقد الأنسجة في المكان عن طريق وضع شبكة على الكرات الشحوم. وضع الأنسجة المتبقية مع غيرها من كأس العين للاستخدام في وقت لاحق. يتم وصف إجراءات مماثلة لتشريح الشبكية في ميدلتون وProtti 16 و Pottek وآخرون 17.
  9. تركيب غرفة تسجيل تحت المجهر تستقيم. على الفور إلى نضح المستمر لشبكية العين مع حل خارج الخلية carboxygenated (35.5 ° C) بمعدل 3-5 مل / دقيقة. تأكد من أن القطب التأريض في مكان.
  10. تعلق على المجهر هو كاميرا رقمية مما يسمح التصور من الأنسجة. مجموعة كاملة حتى يجلس فوق جدول الهواء (امتصاص الصدمة) وداخل قفص فاراداي (كتل المجالات الكهربائية خارجي ثابت وغير ثابت).
  11. بدوره على مصدر الضوء (الأشعة تحت الحمراء،> 850 نانومتر) ومع الهدف 40X، وجلب تركيزها على الهيئات خلية من الخلايا العقدية. العثور على المنطقة الوسطى من جبل لالجامع لRECORأقرع.
  12. تذويب قارورة المجمدة من K + حل يستند إلى داخل الخلايا (300 ميكرولتر، ودرجة الحموضة = 7.4) التي تحتوي على (مم) K-غلوكونات: 140، حامض HEPES: 10، MgCl 2: 4.6، ATP-نا +: 4، GTP نا + : 0.4 و EGTA: 10. جميع الكواشف التي تم شراؤها من سيغما الدريخ.

2. الترقيع الهيئات خلية من خلايا الشبكية العقدة

  1. النار أولا البولندية نهايات البورسليكات الشعرية أنابيب الزجاج، ثم سحب لهم مسرى مكروي بولير الزجاج مع اثنين من الخطوات التدفئة (مقاومة: 5-8 MΩ).
  2. إضافة 3 ميكرولتر من صفراء لوسيفر (تركيز النهائي 0.2٪) إلى حل داخل الخلايا، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي عليه. المقبل، ونقل أفضل 85٪ من الحل في حقنة 1 مل، توصيله إلى 0.22 ميكرون و وحدة التر، ثم إلى 30 G إبرة تحت الجلد قابلة لإعادة الاستخدام. بردت.
  3. إصلاح ماصة الزجاج، من حجم غيض مماثلة لتلك المستخدمة للتسجيلات، على حامله وتحريكه تحت المجهر باستخدام micromanipulaتور. تحت الهدف 40X، ببطء خفض ماصة حتى يجعل نقرة صغيرة على سطح الغشاء الداخلي يحد. بعناية دفع ماصة للأمام حتى أدرك كمية صغيرة من الأنسجة، ومن ثم نقله إلى أعلى و / أو جانبية المسيل للدموع ثقب صغير لفضح الهيئات خلية من الخلايا العقدية. أصغر ثقب، وارتفاع يتم الحفاظ على درجة من سلامة الشبكة الشبكية. إذا رغبت في ذلك، sulforhodamine 101 (SR101؛ 0،5-1 ميكرومتر) ويمكن أن يضاف إلى المتوسطة خارج الخلية لتسمية الخلايا العصبية التالفة باستخدام المجهر مضان 15.
  4. تملأ ماصة نظيفة مع 8-10 ميكرولتر من الحل داخل الخلايا. أدخله في حامل يعلق في مرحلة رئيس مكبر للصوت، وتأكد من أن تغمر المكلورة الفضة القطب كلوريد. إذا تجاهل الأوساخ و / أو فقاعات الهواء هو / هي الحاضر.
  5. بدوره على جميع المعدات. استخدمنا EPC 8 التصحيح مكبر للصوت المشبك تسيطر عليها PatchMaster لتحقيق تسجيلات خلية كاملة في الجهد يخدع المشبكالتشكيل. لاحظ أن مكبرات الصوت الأخرى التي تسمح التسجيلات المشبك الحالية في وضع السرعة التي يمكن أن تستخدم أيضا. تطبيق والحفاظ على ضغط إيجابي في حل ماصة. حدد خلية مع جسم خلية كبيرة وذلك على الأرجح هو الخلايا العقدية بدلا من خلية عديم الاستطالات المشردين أو خلية الدبقية. انخفاض ببطء غيض ماصة لذلك هو جعل نقرة صغيرة على سطح الغشاء، ووقف، والافراج عن الضغط. على الفور إلى انخفاض احتمال عقد ل- 60 بالسيارات. حالما يتم التوصل إلى gigaseal (GΩ) بينهما، وتمتص بلطف لكسر الغشاء لتحقيق خلية كاملة التكوين المشبك التصحيح. هذا الإجراء هو خطوة حساسة، إذا تم تطبيق الكثير من الضغوط السلبية، ثم يصبح اتصال راشح، وإذا كان قليلا جدا، لا يزال الغشاء سليمة.
  6. بمرور الوقت، سوف وسيفر صفراء ملء الخلية، مما يسمح التصور من التشكل الخلية. إذا مستقرة، وهذا ينبغي أن مجموعة المتابعة تستمر 30 دقيقة أو أكثر.

3. تسجيلات من خلايا العقدة عن طريق Dynamiج المشبك

  1. الأول، وهو اختبار الجهد الحالي (من - 75 إلى + 35 بالسيارات كل 10 بالسيارات) يتم تنفيذه باستخدام PatchMaster. الشروع في الاختبارات في وقت لاحق إلا إذا كان نا كبيرة + الحالي (> 1 نا) موجود. لاحظ أنه في مناسبة نادرة حيث يتم مصححة خلية عديم الاستطالات المشردين، في هذه الحالة، لن تستجيب مع القطارات من إمكانات العمل لحقن الحالية اللاحقة.
  2. فتح ابفيف وتنفيذ برنامج مخصص Neuroakuma مكتوبة، ثم تحميل مختلف الطول الموجي تصرف. تعيين عدد تكرار إلى 8 (6-8 لأغراض الإحصائية). تعيين إمكانات عكس المواصلة مثير والمثبطة في 0 و - 75 على التوالي بالسيارات. حدد زوج واحد من المواصلة مطابقة مثير والمثبطة للاختبار. وسوف تتبع تصرف مثير (باللون الأخضر) وتتبع تصرف المثبطة (باللون الأحمر) تظهر في اللوحة السفلى.
  3. العودة إلى PatchMaster، اختر وضع الشبك الحالية، والتبديل على الفور إلى وضع مكبر للصوت الشبك الحالية 'CC + بالاتصالات FAST'. هذا الوضع يسمح لجنة التنسيق الإداريةurately متابعة التغيرات السريعة في غشاء المحتملة. إذا تم الحفاظ على ختم جيدة بين الغشاء وماصة، والقليل / ليس هناك حاجة إلى التعويض، وإلا سوف لن تستمر طويلا تسجيل. في Neuroakuma، اضغط على الزر "السجل". سوف استجابة الخلوية (عادة مع انفجار طوري من إمكانات العمل، الشكل 1A) تظهر على اللوحة العليا. حقن الحالي في الخلية مع زيادة انخفاض المواصلة الأولى، إذا كان قليلا / لوحظ أي رد، زيادة بزيادات صغيرة حتى أنها تنتج رد فعل قوي. الحقن الحالية المفرطة يمكن أن تقتل الخلية. يتم الانتهاء من الاختبارات مرة واحدة، حدد زوج جديد من الطول الموجي تصرف، كرر ما سبق لجميع أزواج من المواصلة الفسيولوجية والاصطناعية. وتستند التيارات الفسيولوجية (I) حقن في الوقت الحقيقي على:
    I (ر) = G غير شامل (ر) × (V م (ر) - V مريض بالحب) + G INH (ر) × (V م (ر) - V INH)

تصرف (G في NS) يمكن أن يكون SYnaptic أو اصطناعية. تم جمع مثير والمثبطة الطول الموجي تصرف متشابك من التجارب السابقة التي يؤديها Protti، دي ماركو، وهوانغ، Vonhoff، نجوين وسليمان (نتائج غير منشورة) في استجابة للمؤثرات بصرية مختلفة في ظروف السيطرة وبحضور سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 1 ميكرومتر) . وعلى غرار الطول الموجي تصرف الاصطناعي باستخدام وظيفة ألفا. V م (في السيارات) هو غشاء المحتملة المسجلة. G مريض بالحب وG INH تمثل المواصلة مثير والمثبطة على التوالي في حين V مريض بالحب وV INH تمثل إمكانات عكس المواصلة مثير والمثبطة على التوالي. الوقت هو ر في مرض التصلب العصبي المتعدد. معدل أخذ العينات هو 40 كيلو هرتز.
I S = I 0 (T / α) E-αt

المعادلة المذكورة أعلاه هي وظيفة ألفا (I = 0 الحد الأقصى الحالي؛ 1 / α = وقت الذروة إلى (ثانية -1) للتيار). الوقت الارتفاع والوقت اضمحلال متشابكتمليه الحالية α 4. كان تصرف مثير دون تغيير في حين أن الكمون للتصرف المثبطة تعديل، والحد من التأخير النسبي لبداية الإثارة (الشكل 2D).

  1. بعد التسجيل، وسحب بعناية ماصة وبالتالي فإن خلايا الجسم يبقى سليما. إصلاح فورا الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث غسلات 10 دقيقة مع 0.1 M من العازلة الفوسفات. بردت وأداء الأجسام المضادة تلطيخ اليوم أو خلال الأسبوع التالي.

4. تلوين الأجسام المضادة ضد لوسيفر الأصفر شغل خلايا الشبكية العقدة

  1. تلوين الأجسام المضادة ضد لوسيفر صفراء خلايا العقدة شغلها في درجة حرارة الغرفة (الابتدائي المضادة للوسيفر صفراء أرنب مفتش (التخفيف = 1:10،000) لمدة خمسة أيام؛ في اليوم السادس، وتلطيخ بين عشية وضحاها مع الثانوية الماعز المضادة للأرنب مفتش (= التخفيف 1:500 )). الرطب تركيب شبكية العين في نيون وسائل الإعلام المحافظة. زلة تغطية وختم مع مسمار عolish.
  2. التقاط صور مبائر من مورفولوجية الخلية باستخدام لايكا المواصفات-II متحد البؤر المجهر (الشكل 1B). وجود اكسون يسمح للتأكيد من الخلايا العقدية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وتتجلى مساهمة مصادر مختلفة من المدخلات المثبطة لاستجابات الخلايا العقدية من خلال تطبيق مختلف الطول الموجي تصرف. وقد تم الحصول على هذه الموجات مع المثيرات من الإنارة مختلفة في الظروف العادية وبحضور TTX، وهو الجهد بوابات نا + قناة مانع يمنع عمل جيل محتمل فقط في مج?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا نقدم لك مجموعة من استخدام المشبك دينامية لتقييم تأثير هذه النسبة، وتوقيت قريب من الإثارة وتثبيط على الشبكية الناتج الخلايا العقدية. المشبك دينامية يجعل من استخدام المحاكاة الحاسوبية لإدخال المواصلة متشابك المسجلة من الناحية الفسيولوجية أو اصطناعية في الخلايا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وقد وافق جميع الإجراءات الأولى من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان من جامعة سيدني، ثم أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الأسترالي من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية (الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا ).

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأسترالي للبحوث (ARC DP0988227) وبحوث العلوم الطبية الحيوية مبادرة منحة من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. المعدات تصحيح مكبر للصوت المشبك EPC 8 تم تمويله من قبل صندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. تم شراء معدات InstruTECH دوا 8 +8 نظام الحصول على البيانات مع الصناديق من مؤسسة ريبيكا كوبر L. وصندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. ونود أن نشكر المراجعين المجهولين للحصول على اقتراحات بصيرة وتعليقاتهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Isoflurane Inhalation AnaestheticPharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, AnhydrousSigma-Aldrich
HEPES Sodium saltSigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/mlInvitrogen
Fluorescent Preserving MediaBioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)Warner Instruments64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode PullerNarishinge JapanModel PP-830
Minipuls 2Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter UnitMillipore CorporationSLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 GSmith Nephew (Australia)
Single Inline Solution HeaterWarner InstrumentsModel SH-27B
Dual Automatic Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objectiveOlympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power SupplyDick Smith ElectronicsQ1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF coolJenoptik
Micromanipulator MP-225Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition SystemHEKA Elektronik
Computer: DELLDell Corporation

References

  1. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
  2. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
  3. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
  4. Johnson, D., Wu, S. M. -S. Foundations of cellular neurophysiology. , The MIT Press. London. (1995).
  5. Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
  6. Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
  7. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
  8. Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
  9. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  10. Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
  11. Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).
  12. Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
  13. Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
  14. Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).
  15. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
  16. Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
  17. Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

75 TTX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved