La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Résumé

Cet article de la vidéo illustre la mise en place, les procédures de patcher les corps cellulaires et la façon de mettre en œuvre les enregistrements de serrage dynamiques à partir de cellules ganglionnaires dans l'ensemble du montage souris rétines. Cette technique permet l'étude de la contribution précise des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs, et leur importance relative et le calendrier de dopage neuronale.

Résumé

cellules ganglionnaires sont les neurones de sortie de la rétine et leur activité reflète l'intégration de multiples entrées synaptiques découlant de circuits neuronaux spécifiques. techniques de patch-clamp, en pince tension et configurations de blocage actuels, sont couramment utilisées pour étudier les propriétés physiologiques des neurones et de caractériser leurs entrées synaptiques. Bien que l'application de ces techniques est très instructif, ils posent diverses limitations. Par exemple, il est difficile de quantifier les interactions précises des entrées excitateurs et inhibiteurs de déterminer sortie de réponse. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé la technique modifiée en cours de serrage, pince dynamique, aussi appelée conductance pince ^{1, 2, 3} et examiné l'impact des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs sur l'excitabilité neuronale. Cette technique nécessite l'injection de courant dans la cellule et dépend de la rétroaction en temps réel de son potentiel de membrane à l'époque. Le injected actuel est calculé à partir des conductances prédéterminées synaptiques excitatrices et inhibitrices, leurs potentiels d'inversion et le potentiel de membrane de la cellule instantanée. Des détails sur les procédures expérimentales, timbre cellules de serrage pour obtenir une configuration cellule entière et l'emploi de la technique du clamp dynamique sont illustrés dans cet article de la vidéo. Ici, nous montrons les réponses des cellules ganglionnaires de la rétine de souris pour diverses formes d'onde de conductance obtenues à partir d'expériences physiologiques dans des conditions de contrôle ou à la présence de drogues. En outre, nous montrons l'utilisation des conductances excitateurs et inhibiteurs artificiels générés en utilisant les fonctions alpha pour étudier les réponses des cellules.

Introduction

La rétine est un tissu neural quasi-transparente qui tapisse le fond de l'œil. De nombreuses études utilisent la rétine comme modèle pour étudier les premières étapes de traitement visuel et les mécanismes de signalisation synaptiques. Puisque le réseau rétinien dans toute la préparation de montage reste intact après la dissection, il représente un système idéal pour étudier les interactions synaptiques que ses réponses physiologiques sont très similaires à la conditions in vivo. Ainsi, en utilisant une rétine isolée les propriétés de ses neurones peuvent être étudiés en utilisant des techniques de patch-clamp (pour les commentaires sur la technique, voir ^6,9,13). Identification de la contribution exacte des circuits et des neurotransmetteurs à la réponse des cellules ganglionnaires spécifiques, cependant, est souvent entravée comme agents pharmacologiques agissent sur différents sites.

Réactions physiologiques des neurones de la rétine à la lumière, la stimulation naturelle, peuvent être enregistrés avec des pipettes en verre remplis de liquide intracellulaire. L'utilisation du patch cltechniques d'amplis, des réponses neuronales à la stimulation lumineuse peuvent être enregistrés en tant que membrane fluctuations potentielles (pince de courant) ou les courants (voltage clamp). En maintenant le potentiel de la membrane à des tensions différentes et la mise en oeuvre d'une analyse a posteriori de conductance, il est possible d'isoler des entrées synaptiques inhibiteurs et excitateurs ^5,12. Ce type d'expériences peut être effectuée dans un milieu de bain normale et en présence de différents agents pharmacologiques d'isoler la contribution de différents neurotransmetteurs et les récepteurs à des réponses neuronales. Un grand nombre d'études de nombreux laboratoires caractérise la dépendance de la production et des intrants de dopage excitateurs et inhibiteurs sur les propriétés de relance telles que la taille, le contraste, les fréquences spatiales et temporelles, la direction, l'orientation et d'autres variables de relance. Bien que ces approches expérimentales fournissent des informations sur la relation entre la production et la flambée des entrées synaptiques en fonction des propriétés de stimulation,interprétation de la contribution de types cellulaires spécifiques et leurs entrées synaptiques à l'excitabilité de la cellule n'est pas simple. Cela est dû au fait que les intrants généralement à la fois excitateurs et inhibiteurs varient en fonction des propriétés de stimulation et donc, il n'est pas possible d'évaluer avec précision l'impact que les changements dans l'une de ces entrées possède le dopage neuronale.

Une approche alternative pour contourner ces limitations est d'effectuer des enregistrements de serrage dynamiques, qui permettent une évaluation critique de la contribution des entrées synaptiques individuels pour dopage sortie. La technique du clamp dynamique permet une injection directe du courant dans la cellule et la quantité de courant injecté à un moment donné dépend du potentiel de membrane enregistré à ce moment ^1,2,3 (pour revue, voir ^7,14). Il s'agit d'une pince en cours de modification mis en place lorsque, une interaction de rétroaction rapide en temps réel entre la cellule dans l'enregistrement et l'appareil comprenant un matériel spécialisé, le logicielet un ordinateur est atteint. La quantité de courant injecté dans la cellule est calculée en conséquence. Par conséquent, l'avantage de cette méthode est que la cellule peut être stimulée avec différentes combinaisons de formes d'onde de conductance, et sa réponse imitera l'activation des récepteurs qui interviennent entrées synaptiques. Par exemple, la comparaison de la réponse à l'injection de conductances excitateurs et inhibiteurs pour une petite tache de la réponse à l'injection de conductance excitatrice pour un petit point seulement fournit des informations sur l'impact de l'inhibition de la réponse cellulaire. De même, d'autres combinaisons de conductances physiologiquement enregistrées peuvent être co-injectée de révéler comment les changements dans conductances excitatrices et / ou inhibitrices stimulus dépendant affecte sortie pic.

Dans notre étude, la technique du clamp dynamique est utilisée pour démontrer l'impact de l'amplitude relative et le calendrier des entrées synaptiques sur les propriétés de cuisson des cellules ganglionnaires de la rétine. Divers conductancesobtenue à partir d'expériences physiologiques dans des conditions de contrôle, ou en présence d'agents pharmacologiques ont été employés en tant qu'entrées. En outre, la conductance artificiels basés sur les fonctions alpha ont également été utilisés afin d'étudier comment les entrées synaptiques sont intégrées par les neurones. Il s'agit donc d'une technique polyvalente qui permet différents types de conductance générés soit physiologiquement, pharmacologique ou de calcul doit être injecté dans la même cellule ganglionnaire, donc la comparaison des réponses à ces entrées peut être faite.

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Protocole

1. Général mis en place et la préparation des tissus

1. Garder la souris dans l'obscurité pendant 30 min (pour but de réduire son niveau de stress). En attendant, préparer 1 litre de solution extracellulaire. D'abord dissoudre 1,9 g de bicarbonate de sodium dans un demi litre d'eau Milli-Q. Son pH est maintenu à 7,4 par barbotage avec 95% de O ₂ et 5% de CO _2. Cinq minutes plus tard, dissoudre 8,8 g de Ames moyenne dans 100 ml d'eau Milli-Q, ajouter à la solution de bicarbonate de sodium, supérieur à 1 L avec de l'eau Milli-Q et bien mélanger. Conserver cette solution carboxygenated pour le reste de l'expérience.
2. Prendre 250 ml de la carboxygenated Ames moyen et mettre en place le système de reperfusion de fluide dans le électrophysiologique set-up. Conserver la solution carboxygenated.
3. Frottis uniformément une fine couche de graisse à vide sur le fond de la chambre de perfusion. Scellez avec une lamelle et assurez-vous qu'il est étanche à l'air. Prendre une petite quantité de graisse (~ 2 mm de diamètre) et le positionner sur le haut et leles extrémités inférieures de la chambre. Ces boules tiendront la grille (cadre de platine enfilées avec du fil dentaire) en place et l'empêcher appuyer trop fort sur la rétine. Fixer la chambre sur la plate-forme et aligner les deux ouvertures.
4. L'animal est d'abord anesthésiés avec isoflurane pendant 2 min, puis sacrifiés par dislocation cervicale. Éliminer rapidement les yeux avec une paire de petits ciseaux (lames courbes), se laver soigneusement avec du liquide extracellulaire carboxygenated dans un petit bol, puis placer dans une boîte de Pétri remplie de liquide extracellulaire carboxygenated.
5. Sous le microscope de dissection, faire un trou d'insertion dans la cornée (~ 2 mm du bord) en utilisant une aiguille de calibre 19. Répétez l'opération pour l'autre œil. Cette étape importante devrait être rapide pour permettre l'oxygénation des deux rétines. Retirer une cornée avec une petite paire de ciseaux à iris en coupant parallèlement à son bord. Ensuite, retirez l'iris et le cristallin avec une paire de pinces fines. Répétez l'opération pour l'autre œil. Transférer une œillère dans un bécher contenantcarboxygenated solution extracellulaire.
6. Avec une lame de scalpel, couper une œillère dans la moitié, pour être en mesure d'aplatir l'ensemble de montage et d'obtenir deux entiers bâtis par la rétine. Séparez délicatement la rétine de l'épithélium pigmentaire utilisant une sonde de dissection émoussée ou en le tirant doucement éteint. Une fois détaché, la rétine est assez transparent. Notez que la surface convexe est du côté des photorécepteurs. La surface concave est du côté des cellules ganglionnaires et il peut coller à elle-même en raison de la présence de corps vitré collante.
7. Avec une paire de pinces fines, maintenez le bord de la fermeture de tissu rétinien détaché à l'ora serrata et de saisir l'ora serrata avec une autre paire de pinces fines, tirez-le vers le centre de la rétine. Il s'agit d'un processus délicat et peut prendre quelques tentatives. En cas de succès, ora serrata, le corps ciliaire et l'humeur vitrée sont éliminés par ce processus, et la courbure de la rétine est réduite (c.-à-plat).
8. Couper les bords, puis le transférer à la personnechambre de fusion avec des cellules ganglionnaires de la face vers le haut. Maintenir le tissu en place en plaçant la grille sur les boules de graisse. Placez le tissu restant avec l'autre œilleton pour une utilisation ultérieure. Des procédures similaires pour dissection rétine sont décrits dans Middleton et Protti ¹⁶ et Pottek et al. ^17.
9. Montez la chambre d'enregistrement sous un microscope droit. Immédiatement mis en place la perfusion continue de la rétine avec une solution extracellulaire carboxygenated (35,5 ° C) à un débit de 3-5 ml / min. Assurez-vous que l'électrode de terre est en place.
10. Fixé sur le microscope est un appareil photo numérique permettant la visualisation du tissu. L'ensemble de l'organisation se trouve au-dessus d'une table air (absorption des chocs) et l'intérieur d'une cage de Faraday (blocs champs électriques statiques et non statiques externes).
11. Allumez la source de lumière (infrarouge,> 850 nm) et avec un objectif 40X, mettre l'accent sur les corps cellulaires des cellules ganglionnaires. Trouvez la zone centrale de l'ensemble de montage pour l 'enregistrementding.
12. Dégivrage Un flacon congelé de K ⁺ solution basée intracellulaire (300 ul, pH = 7,4) contenant (en mM) K-gluconate: 140, de l'acide HEPES: 10, MgCl _2: 4,6, de l'ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0,4 et EGTA: 10. Tous les réactifs achetés auprès de Sigma-Aldrich.

2. Assignation des corps cellulaires des cellules ganglionnaires de la rétine

1. Premier feu polir les extrémités des tubes de verre borosilicate capillaire, puis retirez-les avec une Microelectrode Extracteur de verre avec deux étapes de chauffage (résistance: 5-8 MQ).
2. Ajouter 3 pi de Lucifer Yellow (concentration finale de 0,2%) à la solution intracellulaire, bien mélanger, et centrifuger. Ensuite, transférer les 85% de la solution dans une seringue de 1 ml, connectez-le à une unité de ilter f 0,22 um, puis à une aiguille hypodermique réutilisable 30. Réfrigérer.
3. Fixer la pipette en verre, de la taille de la pointe semblable à ceux utilisés pour les enregistrements, dans son support et passer sous le microscope en utilisant un micromanipulaTor. En vertu d'un objectif 40x, abaissez lentement la pipette jusqu'à ce qu'elle fasse une petite fossette sur la surface de la membrane limitante interne. Avancer avec précaution la pipette jusqu'à ce qu'elle attrape une petite quantité de tissu, puis déplacez-le vers le haut et / ou sur le côté pour arracher un petit trou pour exposer les corps cellulaires des cellules ganglionnaires. Le plus petit trou, plus le degré d'intégrité du réseau rétinien est maintenue. Si on le désire, la sulforhodamine 101 (SR101, de 0,5 à 1 M) peut être ajouté dans le milieu extra-cellulaire pour étiqueter neurones endommagés en utilisant la microscopie à fluorescence ^15.
4. Remplir une pipette propre avec 8 à 10 pi de solution intracellulaire. Insérez-la dans le support fixé au stade de la tête de l'amplificateur et assurez-vous que l'électrode de chlorure d'argent chloré est submergé. Jeter si la saleté et / ou des bulles d'air est / sont présents.
5. Allumez tous les appareils. Nous avons utilisé un amplificateur 8 pièce de serrage EPC contrôlée par PatchMaster pour réaliser des enregistrements de cellules entières dans la pince de tension configuration. Notez que d'autres amplificateurs qui permettent des enregistrements de serrage actuelles en mode rapide peuvent également être utilisés. Appliquer et maintenir une pression positive dans la solution de la pipette. Sélectionner une cellule avec un grand nombre de cellules de sorte qu'il est le plus susceptible d'une cellule ganglionnaire, plutôt que d'une cellule amacrines déplacées ou une cellule gliale. Abaissez lentement la pointe de la pipette afin qu'il apporte une petite fossette sur la surface de la membrane, arrêter et relâcher la pression. Abaisser immédiatement le potentiel de maintien de - 60 mV. Une fois un gigaseal (GQ) est réalisé entre eux, sucer doucement à briser la membrane d'obtenir une configuration de patch clamp de cellules entières. Cette procédure est une étape délicate, si trop de pression négative est appliquée, puis la connexion devient perméable, si trop peu, la membrane reste intacte.
6. Au fil du temps, Lucifer Yellow remplira la cellule, permettant la visualisation de la morphologie de la cellule. Si elle est stable, cette configuration devrait durer 30 minutes ou plus.

3. Enregistrements des cellules ganglionnaires de l'aide Dynamic Clamp

1. Tout d'abord, un test courant-tension (de - 75 à + 35 mV tous les 10 mV) est exécutée en utilisant PatchMaster. Procéder à des tests ultérieurs que si un grand courant Na ⁺ (> 1 nA) est présent. Notez que dans les rares cas où une cellule de amacrine déplacées est patché, dans ce cas, ne répondra pas aux trains de potentiels d'action à des injections actuelles ultérieures.
2. Ouvert LabVIEW et exécuter le programme Neuroakuma écrit personnalisé, puis charger divers formes d'onde de conductance. Définir le nombre de répétition à 8 (6-8 à des fins statistiques). Réglez potentiels d'inversion de conductances excitateurs et inhibiteurs à 0 et - 75 mV respectivement. Choisissez une paire assortie de conductances excitateurs et inhibiteurs pour les tests. Trace de conductance excitateur (en vert) et des traces de conductance inhibitrice (en rouge) apparaissent dans le panneau inférieur.
3. Retour à PatchMaster, sélectionnez le mode pince de courant, et de passer immédiatement l'amplificateur en mode pince de courant «CC + Comm FAST». Ce mode permet d'accurately suivre l'évolution rapide du potentiel de membrane. Si une bonne étanchéité entre la membrane et la pipette est maintenue, peu / pas de compensation est nécessaire, sinon l'enregistrement ne durera pas longtemps. En Neuroakuma, appuyez sur le bouton "enregistrer". La réponse cellulaire (généralement avec une rafale phasic des potentiels d'action, figure 1A) apparaîtra sur le panneau supérieur. Injecter du courant dans la cellule avec une faible mise à l'échelle de la conductance d'abord, si peu / aucune réponse n'est observée, augmenter petit à petit jusqu'à ce qu'il produise une réponse forte. Injection de courant excessif peut tuer la cellule. Une fois les tests terminés, sélectionner une nouvelle paire de formes d'onde de conductance, répétez ce qui précède pour toutes les paires de conductances physiologiques et artificielle. Les courants physiologiques (I) injectées en temps réel sont basés sur:
   I (t) = U _HT (t) x (V _m (t) - V _HT) + U _inh (t) x (V _m (t) - V _INH)

Conductance (G IN NS) pourrait être synaptic ou artificielle. Excitateurs et inhibiteurs synaptique formes d'onde de conductance ont été recueillies à partir d'expériences antérieures effectuées par Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen et Salomon (résultats non publiés) en réponse à différents stimuli visuels dans des conditions de contrôle et en présence de tétrodotoxine (TTX, 1 nM) . Artificial formes d'onde de conductance ont été modélisés en utilisant une fonction alpha. V _m (en mV) est le potentiel de membrane enregistrée. G _HT et G représentent _hab conductances excitateurs et inhibiteurs respectivement, tandis que V _HT et V _hab représentent les potentiels d'inversion de conductances excitateurs et inhibiteurs respectivement. Le temps est t en ms. Taux d'échantillonnage est de 40 kHz.
I _s = I ₀ (t / α) ^e-aT

L'équation ci-dessus est une fonction alpha (I ₀ = courant maximal; 1 / α = temps de pic (s ^-1) du courant). Le temps de montée et temps de descente du synaptiqueactuel est dicté par α ^4. La conductance excitatrice est resté inchangé, tandis que le temps de latence de la conductance inhibitrice a été modifié, ce qui réduit son retard par rapport au début de l'excitation (figure 2D).

4. Après l'enregistrement, retirer soigneusement la pipette de sorte que le corps de la cellule reste intacte. Fixer immédiatement le tissu dans du paraformaldéhyde 4% pendant 30 minutes, suivie de trois lavages de 10 min avec 0,1 M de tampon phosphate. Réfrigérer et effectuer des anticorps tacher le lendemain ou dans une semaine.

4. Anticorps présentent une coloration jaune Lucifer contre les cellules ganglionnaires de la rétine remplis

1. coloration des anticorps contre les cellules ganglionnaires rempli jaune Lucifer à la température ambiante (anti-IgG de lapin Lucifer Yellow primaire (dilution = 1:10.000) pendant cinq jours, le sixième jour, la coloration du jour au lendemain avec secondaire de chèvre anti-IgG de lapin (dilution = 1:500 )). Mouiller monter la rétine fluorescentes médias conservateurs. Couvrir glisser et sceller avec du vernis à pOlish.
2. Prenez des photos confocale de la morphologie des cellules en utilisant un Leica Spec-II microscope confocal (figure 1B). La présence d'un axone permet la confirmation de cellules ganglionnaires.

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Résultats

La contribution des différentes sources d'entrées inhibitrices aux réponses des cellules ganglionnaires est démontrée par l'application de diverses formes d'onde de conductance. Ces formes d'onde ont été obtenus avec des stimuli de luminance différente dans des conditions normales et en présence de TTX, un Na voltage-dépendants ⁺ bloqueur de canal qui bloque l'action de génération potentiel que dans un sous-ensemble des interneurones rétiniens inhibiteurs. Figure 2A

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Discussion

Ici, nous montrons l'utilisation de la pince dynamique pour évaluer l'influence du rapport et de la synchronisation de l'excitation et l'inhibition de la production de cellules ganglionnaires de la rétine. Clamp dynamique rend l'utilisation de simulations informatiques pour introduire conductances synaptiques physiologiquement enregistrées ou artificielle dans les neurones vivants. Cette méthodologie fournit un outil interactif qui conductances peuvent être modifiés et injectés dans les neuron...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation