Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Resumen

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Resumen

Las células ganglionares son las neuronas de salida de la retina y su actividad refleja la integración de múltiples entradas sinápticas derivados de circuitos neuronales específicas. Técnicas de patch clamp, de fijación de voltaje y configuraciones de corriente con la pinza, se utilizan comúnmente para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas y caracterizar sus entradas sinápticas. Aunque la aplicación de estas técnicas es altamente informativo, plantean varias limitaciones. Por ejemplo, es difícil de cuantificar cómo las interacciones exactas de las entradas excitadoras e inhibidoras determinan de salida de respuesta. Para solucionar este problema, se utilizó una técnica de modificación actual abrazadera, abrazadera dinámica, también llamada la conductancia abrazadera ^{1, 2, 3} y examinamos el impacto de entradas sinápticas excitatorios e inhibitorios sobre la excitabilidad neuronal. Esta técnica requiere la inyección de corriente en la célula y es dependiente de la retroalimentación en tiempo real de su potencial de la membrana en ese momento. El injectéd actual se calcula a partir predeterminados conductancias sinápticas excitatorias e inhibitorias, sus potenciales de inversión y instantánea potencial de membrana de la célula. Los detalles de los procedimientos experimentales, patch clamp células para lograr una configuración de célula y el empleo de la técnica de sujeción dinámico se ilustran en este artículo de vídeo. Aquí, se muestra las respuestas de las células ganglionares de la retina de ratón para varias formas de onda de la conductancia obtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en la presencia de drogas. Además, se muestra el uso de las conductancias excitatorios e inhibitorios artificiales generados usando funciones alfa para investigar las respuestas de las células.

Introducción

La retina es un tejido neural casi transparente que recubre la parte posterior del ojo. Muchos estudios utilizan la retina como modelo para investigar los primeros pasos en el procesamiento visual y los mecanismos de señalización sináptica. Dado que la red de la retina en la preparación de todo el montaje se mantiene intacta después de la disección, se representa un sistema ideal para estudiar las interacciones sinápticas como sus respuestas fisiológicas son muy similares a las condiciones in vivo. Por lo tanto, el uso de una retina aislada de las propiedades de las neuronas puede ser estudiado mediante técnicas de patch clamp (para revisiones en la técnica, véase ^6,9,13). Identificación de la contribución exacta de los circuitos y los neurotransmisores a la respuesta de células ganglionares específicos, sin embargo, se ve obstaculizada por lo general como agentes farmacológicos actúan en varios sitios.

Respuestas fisiológicas de neuronas de la retina a la luz, el estímulo natural se pueden grabar con pipetas de vidrio llenos de líquido intracelular. Con cl patchtécnicas de amplificación, las respuestas neuronales a la estimulación de luz se pueden grabar como membrana fluctuaciones potenciales (pinza de corriente) o como corrientes (fijación de voltaje). Al mantener el potencial de membrana a diferentes voltajes y la implementación de un análisis de la conductancia a posteriori, es posible aislar entradas sinápticas inhibitorias y excitatorias ^5,12. Este tipo de experimentos se puede llevar a cabo en un medio de baño normal y en la presencia de diferentes agentes farmacológicos para aislar la contribución de los diferentes neurotransmisores y receptores a las respuestas neuronales. Una gran cantidad de estudios de muchos laboratorios caracteriza la dependencia de la adición de salida y entradas excitatorias e inhibitorias en las propiedades de estímulo, como el tamaño, el contraste, las frecuencias espaciales y temporales, la dirección, orientación y otras variables de estímulo. Aunque estos enfoques experimentales proporcionan información acerca de la relación entre la salida de pico y entradas sinápticas como una función de las propiedades de estímulo,interpretación de la contribución de los tipos de células específicas y de sus entradas sinápticas a la excitabilidad celular no es sencillo. Esto es debido al hecho de que los insumos típicamente tanto excitatorios e inhibitorios varían con las propiedades de estímulo y, por tanto, no es posible evaluar el impacto preciso que los cambios en cualquiera de estas entradas tiene en spiking neuronal.

Un enfoque alternativo para eludir estas limitaciones es para llevar a cabo abrazadera grabaciones dinámicos, que permiten una evaluación crítica de la contribución de las entradas sinápticas individuales para clavar de salida. La técnica de la pinza dinámica permite la inyección directa de la corriente en la célula y la cantidad de corriente inyectada en un momento dado depende del potencial de membrana registrada en ese momento ^1,2,3 (para una revisión, ver ^7,14). Se trata de una pinza de corriente modificada configuración donde a, interacción rápida retroalimentación en tiempo real entre la célula en la grabación y el equipo que comprende hardware especializado, softwarey se logra un ordenador. La cantidad de corriente inyectada en la célula se calcula en consecuencia. Por lo tanto, la ventaja de este método es que la célula puede ser estimulada con diferentes combinaciones de formas de onda de la conductancia, y su respuesta se imitan la activación de los receptores que median las entradas sinápticas. Por ejemplo, la comparación de la respuesta a la inyección de las conductancias de excitación e inhibición para una pequeña mancha con la respuesta a la inyección de la conductancia excitador para un pequeño punto sólo proporciona información sobre el impacto de la inhibición de la respuesta celular. Del mismo modo, otras combinaciones de conductancias registrados fisiológicamente pueden ser co-inyectaron a revelar cómo estímulo dependiente de los cambios en las conductancias excitatorios y / o inhibidor afecta a la salida pico.

En nuestro estudio, la técnica de la pinza dinámica se utiliza para demostrar el impacto de la amplitud relativa y el momento de entradas sinápticas sobre las propiedades de disparo de las células ganglionares de la retina. Varios conductanciasobtenido a partir de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en presencia de agentes farmacológicos fueron empleados como entradas. Además, también se utilizaron las conductancias artificiales basados ​​en funciones alfa con el fin de investigar cómo entradas sinápticas están integrados por las neuronas. Por lo tanto esta es una técnica versátil que permite distintos tipos de conductancia generado ya sea fisiológicamente, farmacológicamente o computacionalmente para ser inyectada en la misma célula ganglionar, lo que la comparación de las respuestas a estas entradas se puede hacer.

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Protocolo

1. Configuración general y preparación de tejidos

1. Mantenga el puntero del ratón en la oscuridad durante 30 min (tratar de reducir su nivel de estrés). Mientras espera, preparar 1 l de solución extracelular. En primer lugar se disuelven 1,9 g de bicarbonato de sodio en medio de un litro de agua Milli-Q. Su pH se mantiene en el 7,4 por burbujeo con un 95% de _O2 y 5% de CO _2. Cinco minutos más tarde, se disuelven 8,8 g de Ames Medio en 100 ml de agua Milli-Q, se suman a la solución de bicarbonato de sodio, superior a 1 L con agua Milli-Q y mezclar bien. Mantener esta solución carboxygenated para el resto del experimento.
2. Tomar 250 ml del carboxygenated Ames medio y establecer el sistema de reperfusión líquido en el electrofisiológico configuración. Guardar la solución carboxygenated.
3. Uniformemente frotis de una capa fina de grasa de vacío en la parte inferior de la cámara de perfusión. Selle con una hoja de cubierta y asegúrese de que es hermético. Tomar una pequeña cantidad de grasa (~ 2 mm de diámetro) y colóquelo en la parte superior eextremos inferiores de la cámara. Estas bolas se mantenga la red (marco de platino colgados con hilo dental) en su lugar y evitar que presionar demasiado sobre la retina. Fije la cámara en la plataforma y alinee los dos orificios.
4. El animal es primero anestesiaron con isoflurano durante 2 min, y luego sacrificadas por dislocación cervical. Quite rápidamente los ojos con un par de tijeras pequeñas (hojas curvas), lavar con abundante líquido extracelular carboxygenated en un pequeño vaso de precipitados, y luego se coloca en una placa de Petri llena de líquido extracelular carboxygenated.
5. Bajo el microscopio de disección, crea un orificio de inserción en la córnea (~ 2 mm del borde) usando una aguja de calibre 19. Repita para el otro ojo. Este importante paso debe ser rápido para permitir la oxigenación de ambas retinas. Retire una córnea con un pequeño par de tijeras de iris mediante la reducción paralela a su borde. A continuación, quitar el iris y la lente con un par de pinzas finas. Repita para el otro ojo. Transferir un ocular en un vaso que contienecarboxygenated solución extracelular.
6. Con una hoja de bisturí, cortar una copa para el ojo en un medio, para ser capaz de aplanar la de todo el montaje y para obtener dos todo-montas por la retina. Separe cuidadosamente la retina del epitelio pigmentario utilizando una sonda de disección roma o tirando de él fuera. Una vez separada, la retina es bastante transparente. Tenga en cuenta la superficie convexa es el lado fotorreceptores. La superficie cóncava es el lado de las células ganglionares y que puede pegarse a sí misma debido a la presencia del humor vítreo pegajosa.
7. Con un par de pinzas finas, mantenga el borde de la retina separada cerca del tejido a la ora serrata y apoderarse de la ora serrata con otro par de pinzas finas, tire de él hacia el centro de la retina. Este es un proceso delicado y puede tomar varios intentos. Si tiene éxito, ora serrata, cuerpo ciliar y el humor vítreo se eliminan mediante este proceso, y la curvatura de la retina se reduce (es decir, plana).
8. Recorte los bordes, y luego transferirlo al porcámara de fusión con las células ganglionares hacia arriba. Mantenga el tejido en su lugar mediante la colocación de la rejilla sobre las bolas de grasa. Coloque el resto del tejido con la otra copa para el ojo para su uso posterior. Procedimientos similares para la disección de la retina se describen en Middleton y Protti ¹⁶ y Pottek et al. ^17.
9. Monte la cámara de grabación bajo un microscopio vertical. Inmediatamente configurar la perfusión continua de la retina con una solución extracelular carboxygenated (35,5 ° C) a una tasa de 3 - 5 ml / min. Asegúrese de que la toma de tierra está en su lugar.
10. Se adjunta a la microscopio es una cámara digital que permite la visualización del tejido. Todo el conjunto se sienta encima de una mesa de aire (amortiguación) y dentro de una jaula de Faraday (bloques de campos eléctricos estáticos y no estáticos externos).
11. Encienda la fuente de luz (infrarroja,> 850 nm) y con un objetivo de 40X, ponga su foco en los cuerpos celulares de las células ganglionares. Encuentra el área central de la de todo el montaje para recording.
12. Descongelar un vial congelado de solución basada en K ⁺ intracelular (300 l, pH = 7,4) que contiene (en mM) K-gluconato: 140, ácido HEPES: 10, _MgCl2: 4,6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0,4 y EGTA: 10. Todos los reactivos adquiridos de Sigma-Aldrich.

2. Cuerpos celulares de parches de células ganglionares retinianas

1. Primera fuego pulir los extremos del tubo capilar de vidrio de borosilicato, luego tire con un extractor de microelectrodos de vidrio con dos etapas de calentamiento (resistencia: 5-8 mW).
2. Añadir 3 l de Amarillo Lucifer (concentración final 0,2%) a la solución intracelular, mezclar bien, y centrifugar. A continuación, transferir el 85% superior de la solución en una jeringa de 1 ml, conectarlo a una unidad de m ilter 0,22 f, y luego a un G aguja hipodérmica reutilizable 30. Refrigere.
3. Fijar la pipeta de vidrio, del tamaño de la punta similar a los utilizados para las grabaciones, en su soporte y moverlo en el microscopio utilizando una micromanipulator. En virtud de un objetivo de 40X, baje lentamente la pipeta hasta que se hace un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana limitante interna. Avanzar con cuidado la pipeta hacia adelante hasta que las capturas de una pequeña cantidad de tejido, y luego moverlo hacia arriba y / o hacia los lados para rasgar un pequeño agujero para exponer los cuerpos celulares de las células ganglionares. Cuanto más pequeño sea el orificio, mayor se mantiene el grado de integridad de la red de la retina. Si se desea, sulforodamina 101 (SR101; 0,5-1 mM) se puede añadir al medio extracelular para etiquetar las neuronas dañadas mediante el uso de microscopía de fluorescencia ^15.
4. Llenar una pipeta limpia con 8-10 l de solución intracelular. Inserte en el soporte fijado a la etapa de la cabeza del amplificador y asegúrese de que el electrodo de cloruro de plata clorada está sumergido. Desechar si la suciedad y / o burbujas de aire es / están presentes.
5. Encienda todos los equipos. Hemos utilizado un amplificador de 8 de patch clamp EPC controlado por PatchMaster para lograr grabaciones de células enteras de fijación de voltaje configuración. Tenga en cuenta que otros amplificadores que permiten grabaciones de corriente con la pinza en el modo rápido también se pueden utilizar. Aplicar y mantener la presión positiva en la solución de la pipeta. Seleccione una celda con un cuerpo de la célula grande, así que lo más probable es una célula de ganglio en lugar de una célula amacrinas desplazadas o una célula glial. Lentamente baje la punta de la pipeta por lo que está haciendo un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana, detener y liberar la presión. Bajar inmediatamente el potencial de mantenimiento de - 60 mV. Una vez que un gigaseal (GΩ) se logra entre ellos, aspirar con cuidado para romper la membrana para lograr una configuración de patch clamp de células enteras. Este procedimiento es una etapa delicada, si se aplica demasiada presión negativa, entonces la conexión se hace con fugas; si es demasiado pequeño, la membrana permanece intacta.
6. Con el tiempo, Amarillo Lucifer va a llenar la celda, permitiendo la visualización de la morfología de la célula. Si es estable, esta configuración debe durar 30 minutos o más.

3. Grabaciones de las células ganglionares Uso Dynamic Clamp

1. En primer lugar, una prueba de corriente-voltaje (de - 75 a + 35 mV cada 10 mV) se ejecuta utilizando PatchMaster. Proceder a las pruebas posteriores sólo si una gran corriente de Na ⁺ (> 1 nA) está presente. Cabe destacar que en las raras ocasiones en que se remienda una célula amacrinas desplazadas, en ese caso, no se responderá con los trenes de potenciales de acción a las inyecciones de corrientes posteriores.
2. Abra LabVIEW y ejecutar el programa Neuroakuma escrita personalizada, cargan varias formas de onda de la conductancia. Establecer el número de repeticiones a 8 (6-8 para fines estadísticos). Establecer los potenciales de inversión de conductancias excitatorios e inhibitorios en 0 y - 75 mV, respectivamente. Seleccione un par a juego de conductancias excitatorios e inhibitorios para la prueba. Trace conductancia excitatorios (en verde) y trace la conductancia inhibitoria (en rojo) aparecerán en el panel inferior.
3. Volver a PatchMaster, seleccione el modo de pinza de corriente y cambiar inmediatamente el amplificador en modo de pinza de corriente 'CC + Comm FAST. Este modo permite accurately seguir los cambios rápidos en el potencial de membrana. Si se mantiene un buen sello entre la membrana y la pipeta, poco / no se necesita compensación, de lo contrario, la grabación no durará mucho tiempo. En Neuroakuma, presione el botón "grabar". La respuesta celular (por lo general con una explosión fásica de potenciales de acción, la figura 1A) aparecerá en el panel superior. Inyecte corriente en la celda con baja escala de conductancias primero, si poco / no se observa respuesta, aumentar en forma gradual hasta que se produce una fuerte respuesta. Inyección de corriente excesiva puede matar a la célula. Una vez que las pruebas se han completado, seleccione un nuevo par de formas de onda de la conductancia, repetir lo anterior para todos los pares de conductancias fisiológicos y artificial. Las corrientes fisiológicas (I) inyectados en tiempo real se basan en:
   I (t) = G _exc (t) x (V _m (t) - V _exc) + G _inh (t) x (V _m (t) - V _inh)

Conductancia (G IN NS) podría ser synaptic o artificial. Excitatorios e inhibitorios formas de onda de la conductancia sináptica se recogieron a partir de experimentos previos realizados por Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen y Solomon (resultados no publicados) en respuesta a diferentes estímulos visuales en condiciones de control y en presencia de la tetrodotoxina (TTX, 1 mM) . Formas de onda de la conductancia Artificial se modelaron usando una función alfa. V _m (en mV) es el potencial de membrana grabada. _Exc T y G _inh representan conductancias excitatorios e inhibitorios respectivamente, mientras que V y V _{exc inh} representan los potenciales de inversión de conductancias excitatorios e inhibitorios respectivamente. El tiempo es t en ms. La velocidad de muestreo es de 40 kHz.
I _s I = ₀ (t / α) ^e-αt

La ecuación anterior es una función alfa (I ₀ = corriente máxima; 1 / α = tiempo hasta el pico ^(seg-1) de la corriente). El tiempo de subida y tiempo de caída del sinápticaactual está dictada por α ^4. La conductancia excitatorio se mantuvo sin cambios, mientras que la latencia de la conductancia inhibitoria fue modificada, reduciendo su retraso con respecto al inicio de la excitación (Figura 2D).

4. Después de grabar, retroceder con cuidado la pipeta para que el cuerpo de la célula se mantiene intacta. Inmediatamente fijar el tejido en 4% de paraformaldehído durante 30 min, seguido de tres lavados de 10 min con 0,1 M de tampón de fosfato. Refrigerar y realizar la tinción de anticuerpos el día siguiente o dentro de una semana.

4. Tinción de anticuerpos contra Lucifer amarillo lleno células ganglionares retinianas

1. La tinción de anticuerpos contra las células ganglionares de Lucifer Yellow llenas a temperatura ambiente (anti-IgG de conejo Amarillo Lucifer primario (dilución = 1:10.000) durante cinco días, en el sexto día, la tinción durante la noche con secundario de cabra anti-IgG de conejo (dilución 1:500 = )). Humedezca montar la retina en fluorescentes Medios Conservación. Cubra resbalar y sellar con esmalte polish.
2. Tomar imágenes confocales de la morfología de las células utilizando un microscopio confocal Leica Spec-II (Figura 1B). La presencia de un axón permite la confirmación de las células ganglionares.

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Resultados

La contribución de las diferentes fuentes de entradas inhibitorias a las respuestas de células ganglionares se demuestra a través de la aplicación de diversas formas de onda de la conductancia. Estas formas de onda se obtuvieron con estímulos de diferente luminancia en condiciones normales y en presencia de TTX, Na ⁺ dependiente de voltaje bloqueador de los canales que bloquea la generación de potencial de acción sólo en un subconjunto de interneuronas inhibidoras de la retina. Figura 2A

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Discusión

Aquí se muestra el uso de la abrazadera dinámico para evaluar la influencia de la relación y la temporización relativa de la excitación y la inhibición en la producción de células ganglionares de la retina. Abrazadera dinámica hace uso de simulaciones por ordenador para introducir conductancias sinápticas fisiológicamente grabados o artificiales en neuronas vivas. Esta metodología proporciona una herramienta interactiva por el cual las conductancias pueden ser modificados y se inyecta en las neuronas para ca...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation