Реализация динамического Хомут с Synaptic и искусственного проводимости в мыши ганглиозных клеток сетчатки

Резюме

Это видео иллюстрирует статью настройки, процедуры, чтобы исправить клеточных тел и, как реализовать динамические записи зажим из ганглиозных клеток в целом монтажа сетчатки мыши. Этот метод позволяет исследовать точное вклад возбуждающих и тормозных синаптических входов, и их относительная величина и сроки нейронов пики.

Аннотация

Ганглий клетки являются выходными нейронами сетчатки и их деятельность отражает интеграцию различных синаптических входов, вытекающих из конкретных нейронных цепей. Патч зажим методы, в напряжении зажим и зажим текущих конфигураций, которые обычно используются для изучения физиологических свойств нейронов и характеризуют их синаптических входов. Хотя применение этих методов является весьма информативным, они представляют различные ограничения. Например, трудно количественно как точное взаимодействие возбуждающих и тормозящих входов определения выходного отклика. Для решения этого вопроса мы использовали модифицированную технику текущего зажим, зажим динамической, которая также называется проводимостью ^{1 зажим, 2, 3} и изучили влияние возбуждающих и тормозных синаптических входов на возбудимость нейронов. Этот метод требует введения ток в клетку и зависит от реального времени обратной связи ее мембранный потенциал в то время. Или введенныхD Текущее рассчитывается по заданной возбуждающих и тормозных синаптических проводимостей, их потенциалы разворот и мгновенная мембранного потенциала клетки. Подробности на экспериментальные процедуры, фиксации потенциала клетки для достижения цельноклеточная конфигурации и занятости метод динамического зажим показано на этом видео статье. Здесь показана реакции мыши ганглиозных клеток сетчатки к различным проводимость сигналов, полученных из физиологических экспериментов в контрольных условиях или в присутствии препаратов. Кроме того, мы покажем использование искусственных возбуждающих и тормозящих проводимость генерируется с использованием альфа-функции для исследования реакции клеток.

Введение

Сетчатка почти прозрачной нервной ткани, выстилающие задней части глаза. Многие исследования сетчатки использовать как модель для изучения первых шагов в обработке зрительной и механизмы синаптической сигнализации. Поскольку сетчатки сети в целом монтажа препарат остается неизменным после вскрытия, он представляет собой идеальную системы для изучения синаптических взаимодействий как его физиологические реакции очень похожи в естественных условиях. Таким образом, в изолированной сетчатки свойства его нейроны могут быть исследованы с помощью методов патч зажим (по отзывам на технике, см. ^6,9,13). Идентификация точной вклада отдельных схем и нейротрансмиттеров ганглий-клеточный ответ, однако, как правило, препятствуют в качестве фармакологических агентов выступают на различных участках.

Физиологические реакции нейронов сетчатки к свету, натуральный раздражитель, могут быть записаны со стеклянной пипетки заполнены внутриклеточной жидкости. Использование патча CLусилитель методы, нейронные ответы на световое раздражение может быть записана как колебания мембранного потенциала (токовые клещи) или в виде токов (напряжения зажим). Путем проведения мембранного потенциала при различных напряжениях и реализации апостериорного анализа проводимости, можно изолировать тормозных и возбуждающих синаптических входов ^5,12. Этот тип эксперименты можно проводить в нормальной среде купание и в присутствии различных фармакологических агентов, чтобы изолировать вклад различных нейротрансмиттеров и рецепторов нейронов ответов. Множество исследований из многих лабораторий характеризуется зависимость пики производства и возбуждающих и тормозных входов на стимул свойства, такие как размер, контрастность, пространственных и временных частот, направление ориентации и другие переменные стимула. Хотя эти экспериментальные подходы предоставить информацию об отношениях между всплеск производства и синаптические входы в зависимости от свойств стимула,Интерпретация вклада специфических типов клеток и их синаптических входов возбудимости клеток не совсем просто. Это связано с тем, что обычно возбуждающие и подавляющие входов зависит стимул свойства и, таким образом, это не возможно оценить точное влияние, что изменения в любом из этих входов имеет на нейронную пики.

Альтернативный подход, чтобы обойти эти ограничения, осуществлять динамическое зажим записи, которые позволяют критически оценить вклад отдельных синаптических входов пики выхода. Динамический метод зажима обеспечивает прямое впрыскивание текущего в камеру и количество ток, подаваемый в данный момент времени, зависит от записанных мембранного потенциала в то время ^1,2,3 (для обзора см. ^7,14). Это изменение текущей зажим настройки, где в режиме реального времени, быстрое взаимодействие обратной связи между клеткой при записи и устройство, содержащее специализированные аппаратные средства, программное обеспечениеи компьютер достигнута. Величина тока, введенный в клетку вычисляется соответственно. Таким образом, преимуществом этого метода является то, что клетки могут быть стимулированы с различными комбинациями проводимость сигналов, и его ответ будет имитировать активации рецепторов, которые опосредуют синаптических входов. Например, сравнение ответ на инъекцию возбуждающих и тормозящих проводимость для небольшого места с ответом на инъекцию возбуждающих проводимости для небольшого места только предоставляет информацию о влиянии ингибирование клеточного ответа. Аналогичным образом, другие комбинации физиологически записаны проводимостей могут быть совместно вводили чтобы показать, как стимул-зависимые изменения в возбуждающих и / или ингибирующим проводимость влияют шип выход.

В нашем исследовании, метод динамического зажим используется для демонстрации влияния относительной амплитуды и времени синаптических входов на огневом свойства ганглиозных клеток сетчатки. Различные проводимостиполученные из физиологической экспериментов в контрольных условиях или в присутствии фармакологических агентов были использованы в качестве входных данных. Кроме того, искусственное проводимости на основе альфа-функции также были использованы для того, чтобы исследовать, как синаптические входы интегрируются нейронов. Таким образом, это универсальный метод, который позволяет различные типы проводимости генерироваться как физиологически, фармакологически или вычислительно, который будет введен в ту же клетку ганглия, так что сравнение ответов на эти входы могут быть сделаны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Генеральный Настройка и Приготовление тканей

1. Держите мышь в темноте в течение 30 мин (направлены на снижение ее уровня стресса). Ожидая, подготовить 1 л внеклеточной решение. Первая растворить 1,9 г бикарбоната натрия в половине литра Milli-Q воды. Ее рН поддерживается на уровне 7,4 путем пропускания с 95% O ₂ и 5% CO _2. Через пять минут, растворить 8,8 г среды Эймса в 100 мл Milli-Q воды, добавить в раствор бикарбоната натрия, долить до 1 л Milli-Q воды и хорошо перемешать. Хранить этот раствор carboxygenated для остальной части эксперимента.
2. Возьмите 250 мл carboxygenated Средний Ames и настроить систему жидкости реперфузии в электрофизиологических установки. Держите решение carboxygenated.
3. Равномерно намазать тонким слоем вакуумной смазки на дно перфузии камеры. Скрепите покровного стекла и убедитесь, что он герметичен. Возьмите небольшое количество смазки (~ 2 мм в диаметре) и поместите его на верхнюю иНижние концы камеры. Эти шары проведет сетки (платина рамка с нанизанными на нитку для чистки зубов) на месте и не допустить его чрезмерного давления на сетчатке. Закрепите камеру на платформу и выровнять оба отверстия.
4. Животное первый анестезировали изофлуран в течение 2 мин, а затем умерщвляли смещением шейных позвонков. Быстрое удаление глаза с парой небольших ножниц (лопатками), тщательно промойте carboxygenated внеклеточной жидкости в небольшой стакан, а затем поместить в чашку Петри с carboxygenated внеклеточной жидкости.
5. Под рассекает микроскоп, сделать установочное отверстие в роговице (~ 2 мм от края) с использованием 19 иглы. Повторите эти действия для другого глаза. Этот важный шаг должен быть быстрым, чтобы позволить оксигенации как сетчатка. Удалите один роговицы с небольшой парой ножниц радужной оболочки за счет сокращения параллельно его краю. Затем удалите радужной оболочки и линзы с пинцета. Повторите эти действия для другого глаза. Передача одного глаза чашку в стакан, содержащийcarboxygenated внеклеточной решение.
6. С лезвие скальпеля, вырезать один глаз чашку пополам, чтобы быть в состоянии сгладить целом монтажа и получить целых два-крепления на сетчатке. Осторожно отделите сетчатки от пигментного эпителия при помощи тупого зонда или рассечения, осторожно потянув его. Как только отдельно, сетчатка достаточно прозрачна. Обратите внимание на выпуклой поверхности фоторецепторов стороны. Вогнутая поверхность боковой ганглиозных клеток и может прилипать к себе благодаря наличию липких стекловидное тело.
7. С парой тонких щипцов, возьмитесь за край отдельных сетчатки близко ткани Ora Serrata и захватить Ora Serrata с другой парой тонких щипцов, потяните его по направлению к центру сетчатки. Это тонкий процесс и может занять несколько попыток. В случае успеха, ора Серрата, цилиарное тело и стекловидного тела удаляются в результате этого процесса, и кривизна сетчатке уменьшается (то есть плоский).
8. Обрезать края, а затем передать его вкамеры для слияния с ганглиозных клеток вверх. Держа ткани в месте размещения сетки на смазку шаров. Поместите оставшиеся ткани с другой чашкой глаз для последующего использования. Аналогичные процедуры для сетчатки рассечение описаны в Мидлтон и Протти ¹⁶ и Pottek соавт. ^17.
9. Установите записи камеры под прямой микроскоп. Немедленно создало непрерывной перфузии сетчатки с carboxygenated внеклеточной решение (35,5 ° C) в размере 3 - 5 мл / мин. Убедитесь, что заземляющий электрод на месте.
10. В приложении к Микроскоп цифровой камеры и возможности визуализации ткани. Целый набор находится над таблицей воздуха (амортизация), так и внутри клетки Фарадея (блоки внешнего статического и не статические электрические поля).
11. Включите источник света (инфракрасный,> 850 нм) и объектив 40Х, привести свое внимание на клеточных тел ганглиозных клеток. Найти центральной площади всего-крепление для RecorДин.
12. Размораживание замороженной пробирке К ⁺ на основе внутриклеточный раствор (300 мкл, рН 7,4), содержащий (в мМ) K-глюконат: 140, HEPES кислота: 10, MgCl _2: 4,6, АТФ-Na ^+: 4, ГТФ-Na ⁺ : 0,4 и ЭГТА: 10. Все реагенты приобретены у Sigma-Aldrich.

2. Исправление клеточных тел ганглиозных клеток сетчатки

1. Первый пожар полировать концы боросиликатного стекла капиллярной трубки, затем потяните их при помощи съемника стекла Микроэлектродные с двумя ступени нагрева (сопротивление: 5 - 8 МОм).
2. Добавить 3 мкл Люцифер Желтый (конечная концентрация 0,2%) с внутриклеточным решение, хорошо перемешать, и центрифуги его. Далее, передача верхний 85% раствор в шприц емкостью 1 мл, подключите его к 0,22 мкм ILTER блока F, а затем в 30 G многоразовый шприц для подкожных инъекций. Охладите.
3. Закрепите стеклянную пипетку, такого же размера чаевых, поскольку те, которые используются для записи, в держатель и переместите его под микроскопом, используя micromanipulaTor. Под объектив 40Х, медленно снизить пипетки, пока он не делает небольшой углубление на поверхности внутренней ограничивающей мембраны. Тщательно продвижения пипетки вперед, пока он не поймает небольшое количество ткани, а затем переместить его вверх и / или в сторону, чтобы оторвать небольшое отверстие, чтобы разоблачить клеточных тел ганглиозных клеток. Чем меньше отверстие, тем выше степень целостности сетчатки сети сохраняется. При желании сульфородамина 101 (SR101, 0,5 - 1 мкм) могут быть добавлены к внеклеточной среде для обозначения поврежденных нейронов с помощью флуоресцентной микроскопии ^15.
4. Заполнение чистой пипетки с 8 - 10 мкл внутриклеточного раствора. Вставьте ее в держатель крепится к голове этап усилителя и убедитесь, что хлорированная электрод хлорида серебра погружен в воду. Откажитесь, если грязь и / или пузырьков воздуха присутствует / присутствуют.
5. Включите все оборудование. Мы использовали EPC 8 патч зажим усилителя контролируется PatchMaster для достижения цельноклеточная записей в напряжении Con зажимконфигурацию. Обратите внимание, что другие усилители, которые позволяют текущие записи зажим в быстром режиме также может быть использован. Применить и поддерживать положительное давление в пипетку решение. Выделите ячейку с большой клетке тела так что скорее всего это ганглиозных клеток, а не перемещенных амакринные клетки или глиальные клетки. Медленно снизить пипетки так что делает небольшое углубление на поверхности мембраны, остановки и сброса давления. Немедленно снизить потенциал для проведения - 60 мВ. После gigaseal (ГОм) достигается между ними, осторожно сосать разорвать мембраны для достижения цельноклеточной патч зажим конфигурации. Эта процедура представляет собой тонкий шаг, если слишком много отрицательное давление, то связь становится вытекающей, а если слишком мало, мембрана остается неповрежденной.
6. Со временем, Люцифер Желтый наполнит клетки, позволяя визуализации морфологии клетки. Если стабильно, эта установка должна длиться 30 минут или больше.

3. Записи ганглиозных клеток Использование DynamiC зажим

1. Во-первых, ток-напряжение теста (от - 75 до + 35 мВ каждые 10 мВ) выполняется с использованием PatchMaster. Перейдите к более последние испытания, только если большое Na ⁺ ток (> 1 нА) присутствует. Отметим, что в тех редких случаях, где перемещенные ячейки амакринные пропатчена, в таком случае, не будет реагировать с поездами потенциалов действия в последующих текущих инъекций.
2. Открытое LabVIEW и выполнить обычай письменных Neuroakuma программы, а затем загрузить различные проводимости сигналов. Установите количество повторений до 8 (6 - 8 для статистических целей). Установить разворот потенциалов возбуждающих и тормозящих проводимости при 0 и - 75 мВ соответственно. Выберите одну подходящую пару возбуждающих и тормозящих проводимость для тестирования. Возбуждающие след проводимости (в зеленом) и тормозного следа проводимости (в красном) появится в нижней панели.
3. Вернуться к PatchMaster выберите текущем режиме зажим, и сразу же включит усилитель в текущем режиме зажим «CC + Comm быстрым". Этот режим позволяет Точностьurately следить за быстрыми изменениями мембранного потенциала. Если хорошее уплотнение между мембраной и пипетки сохраняется, мало / без компенсации не требуется, в противном случае запись не будет длиться долго. В Neuroakuma, нажмите кнопку «Запись». Клеточного ответа (как правило, с фазовых взрыв потенциалов действия, рис. 1А) появится на верхней панели. Подачи тока в клетку с низкой проводимости масштабирование Во-первых, если мало / ответа не наблюдается, увеличение с небольшим шагом, пока он не производит решительного ответа. Избыточный ток инъекции может убить клетку. Как только тесты будут завершены, выбрать новую пару проводимости сигналов, повторите для всех пар физиологических и искусственных проводимости. Физиологических токов (I) вводят в реальном времени на основе:
   (Т) = G _отл (Т) х (V _{М (Т)} - _отл V) + G _Н (Т) х (V _{М (Т)} - V _чел)

Проводимости (G в нс) может быть сиnaptic или искусственные. Возбуждающих и тормозящих сигналов синаптической проводимости были собраны из предыдущих экспериментов выполняемых Протти, Ди Марко, Хуан, Vonhoff, Нгуен и Соломона (неопубликованные результаты) в ответ на различные визуальные стимулы в контрольных условиях и в присутствии тетродотоксин (ТТХ, 1 мкм) . Искусственный проводимости сигналов были смоделированы с использованием альфа-функции. V _м (в мВ) представл ет собой записанные мембранного потенциала. G и G _{отл чел} представляют возбуждающих и тормозящих проводимость соответственно в то время как V и V _{отл чел} представляют разворот потенциалов возбуждающих и тормозящих проводимости соответственно. Время Т в мс. Частота дискретизации 40 кГц.
Я _S = I ₀ (т / ^α) Электронная ^{вида ɑØ}

Приведенное выше уравнение представляет собой альфа функции (I ₀ = максимальный ток; 1 / α = время до пика (сек ^-1) текущих). Время нарастания и времени спада синаптическихток диктуется α ^4. Возбуждающие проводимость не изменилась в то время как задержка ингибирующих проводимость была изменена, снижая его задержкой относительно начала возбуждения (рис. 2D).

4. После записи тщательно убрать пипетку так тело клетки остаются нетронутыми. Сразу зафиксировать ткани в 4% параформальдегид в течение 30 мин, а затем три 10 мин промывки 0,1 М фосфатного буфера. Охладите и выполнять окрашивание антител на следующий день или в течение недели.

4. Окрашивание антител против Люцифера Желтый Заполненные ганглиозных клеток сетчатки

1. Антитела против окрашивания Lucifer желтый заполненный ганглиозных клеток при комнатной температуре (первичные анти-Lucifer Желтый IgG кролика (разведение = 1:10000) в течение пяти дней, на шестой день в течение ночи окрашивания вторичный козьих антител против кроличьего IgG (разбавление 1:500 = )). Мокрые горы сетчатки в люминесцентных Сохранение медиа. Покровного стекла и печать с ногтей Polish.
2. Возьмите конфокальной картины клеточной морфологии использованием Leica Spec-II конфокальной микроскопии (рис. 1В). Наличие аксон дает подтверждение ганглиозных клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Вклад различных источников тормозных входов к ответам ганглиозных клеток показано, за счет применения различных проводимости сигналов. Эти сигналы были получены при различных стимулов яркости в нормальных условиях и в присутствии ТТХ, напряжения закрытого Na ^{+-канала} блокатор, к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь показано использование динамического зажим, чтобы оценить влияние соотношения и относительной синхронизации возбуждения и торможения на выходе сетчатки ганглиозных клеток. Динамический зажим использует компьютерное моделирование, чтобы ввести физиологически записанных или ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation