Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Özet

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Özet

Ganglion hücrelerinin retinanın çıkış nöronlar ve faaliyetlerini belirli sinir devrelerinden kaynaklanan birden fazla sinaptik girdi entegrasyonu yansıtır. Voltaj-kıskaç ve akım kelepçe yapılandırmalarda yama kıskaç teknikleri, yaygın olarak nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için ve sinaptik girişleri karakterize etmek için kullanılır. Bu tekniklerin uygulanması son derece bilgilendirici olmasına rağmen, onlar çeşitli sınırlamalar oluşturmaktadır. Örneğin, eksitatör ve inhibitör girdi kesin etkileşimleri tepki çıkışı nasıl etkilediğini ölçmek zordur. Bu sorunu gidermek için, biz de iletkenlik kelepçe ^{1, 2, 3} olarak adlandırılan değiştirilmiş bir akım kelepçe tekniği, dinamik kelepçe, kullanılan ve sinirsel uyarıların üzerinde eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi etkisini inceledi. Bu teknik, hücre içine akım enjeksiyon gerektirir ve o zaman onun membran potansiyelinin gerçek zamanlı geribildirim bağlıdır. Enjekted mevcut önceden belirlenmiş eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlikleri, onların ters potansiyelleri ve hücrenin anlık membran potansiyeli hesaplanır. Deney prosedürleri ile ilgili ayrıntılar, dinamik sıkıştırma tekniğinin bir bütün hücre konfigürasyonu ve iş elde etmek için hücreleri sıkma yama Bu video makalede de gösterilmiştir. Burada, kumanda koşullarda ya da ilaç mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli iletkenlik dalga fare retinal ganglion hücre sırasında olan tepkileri gösterir. Ayrıca, hücre yanıtları incelemektir alfa fonksiyonları kullanarak oluşturulan suni eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri kullanılmasını gösterir.

Giriş

Retina gözün arka astar yakın bir şeffaf sinir dokudur. Birçok çalışma, ilk görsel işleme adımları ve sinaptik sinyal mekanizmaları araştırmak için model olarak retina kullanın. Tüm montaj hazırlanmasında retina ağ diseksiyonu sonra bozulmadan kaldığı için, onun fizyolojik yanıtlar in vivo koşullarda çok benzer olarak sinaptik etkileşimleri çalışmak için ideal bir sistem temsil eder. Böylece, kendi nöronların özelliklerini yama kelepçe teknikleri (tekniği ile ilgili yorumlar için, ^6,9,13 bakınız) kullanılarak incelenebilir izole bir retina kullanarak. Farmakolojik ajanlar çeşitli sitelerde hareket gibi özel devreler ve ganglion hücre yanıt nörotransmitterlerin tam katkısının belirlenmesi, ancak, genellikle engellenmektedir.

Işık retina nöronların fizyolojik yanıtlar, doğal uyarıcı, hücre içi sıvı dolu cam pipetler ile kaydedilebilir. Yama cl kullanarakamp teknikleri, ışık uyarılması nöronal yanıtları membran potansiyeli dalgalanmaları (Güncel kelepçe) veya akım (voltaj kelepçe) olarak kaydedilebilir. Farklı gerilimlerde membran potansiyeli tutarak ve sonradan iletkenlik analizi uygulayarak, bu inhibitör ve eksitatör sinaptik girdi ^5,12 izole etmek mümkündür. Bu tür deneyler normal bir banyo ortamı içinde ve farklı nörotransmitter ve nöronal yanıtları reseptörlerinin katkı yalıtmak için farklı farmakolojik ajanların varlığında gerçekleştirilebilir. Birçok laboratuarlardan çalışmaların bir zenginlik spike çıktı ve uyarıcı boyut gibi özellikleri, kontrast, mekansal ve zamansal frekansları, yön, yönlendirme ve diğer uyarıcı değişkenlere eksitatör ve inhibitör girdi bağımlılığı karakterize. Bu deneysel yaklaşımlar başak çıkışı ve uyarıcı özellikleri bir fonksiyonu olarak sinaptik girişleri arasındaki ilişki hakkında bilgi vermek olsa da,hücre uyarılma özgü hücre tipleri ve sinaptik girdi katkısı yorumlanması kolay değildir. Bu, tipik olarak uyarıcı ve inhibitör girişi uyarıcı özelliklerine bağlı olarak değişir ve bu nedenle, bu girişlerin her biri değişiklikler nöronal spike üzerinde sahip olduğu kesin etkisini değerlendirmek mümkün değildir olmasından kaynaklanmaktadır.

Bu sınırlamalar aşmak için alternatif bir yaklaşım çıkış spike bireysel sinaptik girdi katkısı bir eleştirel değerlendirme izin dinamik kelepçe kayıtları üzerinden taşımaktır. Dinamik kelepçe tekniği hücreye akım direkt enjeksiyon sağlayan ve belirli bir zamanda mevcut enjekte miktarı o zaman ^1,2,3 (inceleme için, ^7,14 bakınız) kaydedilen membran potansiyeline bağlıdır. Bu modifiye edilmiş bir akım kelepçe set-up olduğu kayıt altında hücre ve özel donanıma oluşan donanım, yazılım arasında gerçek zamanlı, hızlı geri besleme etkileşimve bir bilgisayar elde edilir. Hücreye geçerli enjekte miktarı buna göre hesaplanır. Bu nedenle, bu yöntemin avantajı hücre iletkenlik dalga farklı kombinasyonları ile stimüle edilebilir, ve tepki sinaptik girdi aracılık reseptörlerinin aktivasyonu taklit edecek olmasıdır. Örneğin, küçük bir nokta için uyarıcı iletkenlik enjeksiyonu için tepki ile küçük bir nokta için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri enjeksiyonu yanıt karşılaştırılması sadece hücre yanıt inhibisyonu etkisi hakkında bilgi sağlar. Aynı şekilde, fizyolojik olarak kaydedilen iletkenlikleri diğer kombinasyonları başak çıkış nasıl etkilediğini uyarıcı bağımlı eksitatör ve / veya inhibitör iletkenlikleri değişiklikleri ortaya çıkarmak için birlikte enjekte edilebilir.

Bizim çalışmamızda, dinamik klemp tekniği nispi genlik ve retinal ganglion hücreleri ateşleme özelliklerine sinaptik girdi zamanlamasının etkisini göstermek için kullanılır. Çeşitli iletkenlikleriKontrol koşullarında ya da farmakolojik ajanların mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen girdi olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak, alfa fonksiyonları dayalı yapay iletkenlikleri de sinaptik girişleri nöronlar tarafından entegre nasıl araştırmak amacıyla kullanılmıştır. Bu nedenle, bu iletkenlik çeşitli farmakolojik olarak veya hesaplama aynı ganglion hücre içine enjekte edilmesi, ya da fizyolojik olarak oluşturulur, bu uçlara tepkilerin nedenle karşılaştırma yapılabilir sağlayan çok yönlü bir tekniktir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Genel Kurma ve Doku Hazırlama

1. 30 dakika (kendi stres düzeyini azaltmak amacı) için karanlıkta fare tutun. Beklerken, hücre dışı çözelti 1 L hazırlar. Üretim Milli-Q su içinde yarım litre sodyum bikarbonat ve 1.9 g çözülür. PH değeri% 95 _O2 ve% 5 _CO2 ile kabarcıklar ile 7.4 'de muhafaza edilmektedir. Beş dakika sonra, Milli-Q su ile 1 L'ye kadar iyi, sodyum bikarbonat çözeltisine ilave edildi, Milli-Q su içinde, 100 ml Ames Orta 8.8 g çözülür ve iyice karıştırın. Deney geri kalanı için carboxygenated bu çözüm tutun.
2. Carboxygenated Ames Orta 250 ml alın ve elektrofizyolojik olarak sıvı reperfüzyon sistem set-up kurmak. Çözüm carboxygenated tutun.
3. Düzgün smear perfüzyon odasının alt üzerine vakum gres ince bir tabaka. Bir kapak kayma ile Seal ve hava geçirmez olduğundan emin olun. Yağ (çapı yaklaşık 2 mm), küçük bir miktar alın ve üstüne yerleştirmek vealt odasının biter. Bu toplar yerine ızgara (platin çerçeve diş ipi ile sinirli) tutun ve retina çok sert basarak önleyecektir. Platformun üzerine odası düzeltmek ve her iki açıklıklar hizalayın.
4. Hayvan servikal dislokasyon ile sakrifiye sonra 2 dakika ve için İsofluranın ilk anestezi olduğunu. Hızlı bir şekilde küçük makas (eğik kanatlı) bir çift gözleri kaldırmak, carboxygenated hücre dışı sıvı ile dolu bir Petri kabındaki yerleştirin daha sonra küçük bir beher carboxygenated hücre dışı sıvı ile iyice yıkayın, ve.
5. Diseksiyon mikroskobu altında, 19 gauge iğne kullanılarak kornea bir ekleme delik (kenarından ~ 2 mm) yapmak. Diğer göz için tekrarlayın. Bu önemli bir adım hem retinae bir oksijen sağlamak için hızlı olmalıdır. Kenarından paralel keserek iris makası küçük bir çift ile bir kornea çıkarın. Daha sonra, ince forseps bir çift ile iris ve lens çıkarın. Diğer göz için tekrarlayın. Içeren bir beher içine bir göz fincan transferhücre-dışı çözelti carboxygenated.
6. Bir neşter bıçak ile, tüm montaj düzleştirmek ve retina başına iki tam bağlar elde edebilmek için, yarım içine bir göz fincan kesti. Bir künt diseksiyon prob kullanılarak pigment epitel veya hafifçe çekerek retina dikkatle ayırın. Bir kez müstakil, retina oldukça şeffaftır. Dışbükey yüzey fotoreseptör tarafı unutmayın. Içbükey yüzeyi ile ganglion hücrelerinde tarafı ve yapışkan vitreus mizah varlığı nedeniyle kendisini yapışabilir.
7. Ince forseps bir çift, ora serrata için müstakil retina dokusunun yakın kenarında tutun ve ince forseps başka bir çift ile ora serrata kapmak, retinanın merkezine doğru çekin. Bu hassas bir süreçtir ve birkaç girişimleri alabilir. Eğer başarılı olursa, ora serrata, siliyer cisim ve vitreus mizah bu işlem tarafından kaldırılır ve retinanın eğrilik (yani düz) azalır.
8. Kesme kenarları, ve daha sonra başına aktarmakyukarı bakacak şekilde ganglion hücrelerinin ile füzyon odası. Yağ topları üzerine ızgara yerleştirerek yerinde doku tutun. Daha sonra kullanmak için diğer göz fincan kalan doku yerleştirin. Retina diseksiyon için benzer prosedürler Middleton ve Protti ¹⁶ ve Pottek ark tarif edilmiştir. ^17.
9. Dik bir mikroskop altında kayıt odasına monte edin. 5 ml / dak - hemen 3 oranında carboxygenated ekstrasellüler çözüm (35.5 ° C) ile retina sürekli perfüzyon kurmak. Topraklama elektrot yerinde olduğundan emin olun.
10. Mikroskop bağlı doku görselleştirme sağlayan bir dijital fotoğraf makinesi. Tüm kurulum bir hava tablosu (darbe emme) üzerinde ve bir Faraday kafesi (blok dış statik ve statik olmayan elektrik alanları) içinde oturur.
11. Işık kaynağı (kızılötesi,> 850 nm) ve bir 40X objektif ile açın, ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri üzerine odağını getirmek. Recor için tüm montaj orta bölgesinde bulding.
12. Defrost K Dondurulmuş bir şişe ⁺ tabanlı hücre içi çözelti (300 ul, pH değeri = 7.4) ihtiva eden (mM olarak), K-glukonat: 140, HEPES asit: 10, _MgCl2: 4,6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0.4 ve EGTA: 10. Tüm reaktifler, Sigma-Aldrich'ten satın alınmıştır.

2. Retina Ganglion Hücre yama Hücre Organları

1. İlk ateş borosilikat kılcal cam boru ucunda lehçe, daha sonra iki ısıtma adım (: - MQ 8 5 direnci) ile bir cam Mikroelektrod Çektirme ile çekin.
2. Hücre içi çözelti Lucifer sarının 3 ul (nihai konsantrasyon% 0.2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjlenir. Sonra, bir 30 G yeniden hipodermik iğne, sonra, 1 ml'lik bir şırınga içine çözelti üstüne% 85 aktarmak için 0.22 um f ilter ünitesine bağlanır. Buzdolabında.
3. Tutucuya, kayıtlar için kullanılan benzer uç boyutu, cam pipet düzeltmek ve bir micromanipula kullanarak mikroskop altında harekettor. Bu iç sınırlayıcı membranı yüzeyinde küçük bir çukur edinceye kadar 40X objektif altında, yavaş yavaş pipet düşürmektedir. Bu doku küçük bir miktar yakalar kadar dikkatlice ileri pipet ilerlemek ve sonra ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri ortaya çıkarmak için küçük bir delik gözyaşı yukarı ve / veya yana doğru hareket ettirin. Daha küçük delik, yüksek retina ağın bütünlüğü derecesi muhafaza edilmektedir. Eğer arzu edilirse, sülforhodamin 101 (SR101, 0,5-1 uM), ¹⁵ floresan mikroskobu kullanılarak hasar görmüş nöronların etiketlemek için hücre dışı ortama ilave edilebilir.
4. Hücre içi çözüm 10 ul - 8 ile temiz bir pipet doldurun. Amplifikatör kafası aşamasına bağlı tutucu içine yerleştirin ve klorlu gümüş klorür elektrot altında olduğundan emin olun. Eğer kir ve / veya hava kabarcıkları olan / mevcut atın.
5. Tüm ekipmanları açın. Biz gerilim kelepçe con tam hücreli kayıtları elde etmek için PatchMaster tarafından kontrol edilen bir EPC 8 yama kelepçe amplifikatör kullanılırfigürasyon. Hızlı modunda mevcut kelepçe kayıtları sağlayan diğer amplifikatör de kullanılabilir unutmayın. Pipet çözüm pozitif basınç uygulayın ve korumak. Oldukça bir yerinden amacrine hücre veya glial hücre daha ganglion hücre bu yüzden büyük olasılıkla büyük bir hücre gövdesi ile bir hücre seçin. Yavaşça, membran yüzeyinde küçük bir çukur yapma böylece, pipet alt durdurma ve basınç serbest bırakın. 60 mV - derhal tutma potansiyeli düşük. Bir gigaseal (GΩ) aralarında elde sonra, hafifçe bir tam hücreli yama kelepçe yapılandırma elde etmek için membran kırmak için emmek. Bu işlem çok fazla negatif basınç uygulanırsa, o zaman bağlantı sızan olur, hassas bir adımdır, çok az ise, membran bozulmadan kalır.
6. Zamanla, Lucifer Sarı hücrenin morfolojisi görselleştirme sağlayan, hücre dolduracaktır. Kararlı, bu kurulum 30 dakika veya daha fazla sürmelidir.

3. Dynami kullanarak Ganglion Hücreleri kayıtlarıc Kelepçe

1. İlk olarak, bir akım-gerilim testi (gelen - 75 + 35 mV her 10 mV) PatchMaster kullanılarak yürütülür. Büyük bir Na ⁺ akımı (> 1 nA) mevcut olması halinde daha sonra testlere devam edin. Bir yerinden amacrine hücre yamalı nadir olarak, bu durumda, sonraki mevcut enjeksiyon için harekete potansiyelleri trenler ile cevap unutmayın.
2. Açık LabVIEW ve özel yazılmış Neuroakuma programı çalıştırmak, daha sonra çeşitli iletkenlik dalga yükleyin. 8 (- 8 istatistik amacıyla 6) için tekrar sayısını ayarlayın. Sırasıyla 75 mV - 0 ve de eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri iptali potansiyelleri ayarlayın. Test için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri birini eşleşen çifti seçin. Eksitatör iletkenlik iz (yeşil) ve inhibitör iletkenlik iz (kırmızı) alt panelinde görünür.
3. Geri PatchMaster git, mevcut kelepçe modunu seçin, ve hemen 'CC + İletişim HIZLI' mevcut kelepçe moduna amplifikatör geçin. Bu mod acc sağlarurately membran potansiyeli hızlı değişiklikleri takip edin. Membran ve pipet arasında iyi bir sızdırmazlık bakımı yapılırsa, az / hiçbir tazminat gereklidir, aksi halde, kayıt uzun sürmez. Neuroakuma olarak, "kayıt" düğmesine basın. Hücresel yanıt (genellikle aksiyon potansiyelleri bir fazik patlama, Şekil 1A ile) üst panelinde görünür. Az / cevap görülmektedir eğer sert tepki üretir kadar, küçük artışlarla artırmak, ilk iletkenlikleri düşük ölçeklendirme ile hücre içine akım enjekte edilir. Aşırı akım enjeksiyon hücre öldürebilir. Bir kez testleri tamamlandığında, iletkenlik dalga yeni bir çift seçin fizyolojik ve yapay iletkenlikleri tüm çiftleri için yukarıdaki tekrarlayın. Gerçek zamanlı olarak enjekte fizyolojik akımları (I) dayanmaktadır:
   I (t) = _Hariç G (t) X (V _m (t) - V _hata) + G _inh (t) X (V _m (t) - V _inh)

Iletkenlik (nS G) sy olabilirnaptic ya da yapay. Eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlik dalga (TTX, 1 mcM) kontrol koşulları farklı görsel uyaranlara yanıt olarak ve tetrodotoxin varlığında Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen ve Solomon (yayınlanmamış) tarafından gerçekleştirilen önceki deneyler toplanmıştır . Yapay iletkenlik dalga bir alfa işlevi kullanılarak modellenmiştir. V _m (mV), kaydedilen membran potansiyeldir. V _hariç ve V _inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri en ters potansiyelleri temsil ederken G _hariç ve G _inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri temsil eder. Zaman ms t. Örnekleme oranı 40 kHz.
Ben _s = I ₀ (t / α) ^{E-Ht olarak}

Yukarıdaki denklem bir alfa fonksiyonu (, akımın zirvesine 1 / α = zaman (sn ^-1) I ₀ = maksimum akım) 'dir. Yükselme zamanı ve sinaptik çürüme süresiMevcut α ⁴ tarafından belirlenir. Inhibitör iletkenlik ve gecikme uyarma başlangıcı (Şekil 2B) göre kendi gecikme azaltarak, güncellenmiştir iken eksitatör iletkenlik değişmedi.

4. Hücre gövdesi sağlam kalması için Kayıttan sonra, dikkatli bir pipet geri çekin. Hemen fosfat tamponu, 0.1 M, üç adet 10 dakika yıkama ve ardından 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde doku çözmek. Buzdolabında ve ertesi gün ya da bir hafta içinde boyama antikor gerçekleştirin.

4. Lucifer Sarı Dolgulu Retina Ganglion Hücreleri Karşı Antikor Boyama

1. İkincil keçi anti-tavşan IgG (seyreltme = 1:500 ile altıncı gününde, gece boyama; oda sıcaklığında Lucifer Sarı dolu ganglion hücrelerinin (beş gün boyunca birincil anti-Lucifer Sarı tavşan IgG (seyreltme = 1:10,000) karşı antikor boyama )). Floresan korunması Medya retina monte ıslatın. Tırnak p kayma ve mühür Kapakolish.
2. Leica Spec-II konfokal mikroskop (Şekil 1B) kullanarak hücre morfolojisinin konfokal fotoğraf çekmek. Bir akson varlığı ganglion hücrelerinin onay verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Ganglion hücre yanıtları inhibitör girdi farklı kaynaklardan katkısı çeşitli iletkenlik dalga uygulaması ile gösterilmiştir. Bu dalga formları, normal koşullarda ve bloklar tesirinin inhibitör retina internöron bir alt potansiyel üretimi sağlar. Şekil 2A, enjeksiyon için temsili bir tepki gösterir TTX bir voltaj kapılı Na ⁺ kanal engelleyicisi varlığında, farklı parlaklık uyarıcı ile elde edilmiştir eksitatör ve inhibitör iletkenlik dalga normal şartlarda gri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada oranı ve uyarma ve retina ganglion hücre çıkış inhibe göreli zamanlama etkisini değerlendirmek için dinamik kelepçe kullanımını göstermektedir. Dinamik kelepçe yaşayan nöronların içine fizyolojik kaydedilmiş veya yapay sinaptik iletkenlikleri tanıtmak için bilgisayar simülasyonları kullanır. Bu metodoloji iletkenlikleri değiştirilmiş ve nöronal yanıtları üzerindeki etkilerini hesaplamak için nöronlar enjekte edilebilir hangi interaktif bir araçtır. İletkenlik dalga görsel uya...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation