Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Riepilogo

In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.

Abstract

Cellule gangliari sono i neuroni della retina uscita e la loro attività riflette l'integrazione di più ingressi sinaptici derivanti da specifici circuiti neurali. Tecniche di patch clamp, in morsetto di tensione e di configurazioni di corrente con la pinza, sono comunemente usati per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni e di caratterizzare i loro ingressi sinaptici. Anche se l'applicazione di queste tecniche è altamente informativo, essi rappresentano varie limitazioni. Ad esempio, è difficile quantificare le interazioni precise di ingressi eccitatori e inibitori determinano output di risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato una tecnica modificata corrente morsetto, morsetto dinamica, detto anche conduttanza morsetto ^{1, 2, 3} e ha esaminato l'impatto di input sinaptici eccitatori e inibitori di eccitabilità neuronale. Questa tecnica richiede l'iniezione di corrente nella cella e dipende dal feedback in tempo reale del suo potenziale di membrana in quel momento. Il injectéd attuale è calcolato a partire predeterminati conduttanze sinaptiche eccitatorie ed inibitorie, le loro potenzialità di inversione e istantanea potenziale di membrana della cellula. Dettagli sulle procedure sperimentali, la patch di serraggio cellule per ottenere una cellula intera configurazione e impiego della tecnica di serraggio dinamica sono illustrati in questo articolo il video. Qui vi mostriamo le risposte di topo cellule gangliari della retina a varie forme d'onda conduttanza ottenuti da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di farmaci. Inoltre, mostriamo l'utilizzo di conduttanze eccitatori e inibitori artificiali generati utilizzando le funzioni alfa per indagare le risposte delle cellule.

Introduzione

La retina è un tessuto neurale quasi trasparente che riveste la parte posteriore dell'occhio. Molti studi utilizzano la retina come modello per studiare i primi passi nel processo visivo e meccanismi di segnalazione sinaptica. Poiché la rete retinica nel preparato tutto il montaggio rimane intatto dopo la dissezione, rappresenta un sistema ideale per studiare le interazioni sinaptiche come sue risposte fisiologiche sono molto simili a condizioni in vivo. Così, utilizzando una retina isolata proprietà dei suoi neuroni possono essere studiati con tecniche di patch clamp (per recensioni su questa tecnica, vedere ^6,9,13). Identificazione dell'esatto contributo di circuiti e neurotrasmettitori alla risposta delle cellule gangliari specifici, tuttavia, è di solito ostacolata come agenti farmacologici agiscono su vari siti.

Risposte fisiologiche dei neuroni della retina alla luce, lo stimolo naturale, possono essere registrati con pipette di vetro riempiti di liquido intracellulare. Utilizzando cerotto cltecniche di amplificazione, le risposte neuronali alla stimolazione luminosa possono essere registrati come potenziale di membrana fluttuazioni (pinza amperometrica) o come correnti (morsetto di tensione). Tenendo il potenziale di membrana con diverse tensioni e attuare una analisi conduttanza posteriori, è possibile isolare input sinaptici inibitori ed eccitatori ^5,12. Questo tipo di esperimenti può essere effettuata in normale medio balneazione e in presenza di agenti farmacologici differenti per isolare il contributo delle varie neurotrasmettitori e recettori per risposte neuronali. Un patrimonio di studi da molti laboratori caratterizza la dipendenza di chiodare di uscita e ingressi eccitatori e inibitori sulle proprietà di stimolo come la dimensione, contrasto, frequenze spaziali e temporali, la direzione, l'orientamento e altre variabili di stimolo. Anche se questi approcci sperimentali forniscono informazioni circa il rapporto tra la produzione e il picco ingressi sinaptici in funzione delle proprietà di stimolo,interpretazione del contributo di specifici tipi cellulari e le loro ingressi sinaptici a eccitabilità delle cellule non è semplice. Ciò è dovuto al fatto che gli ingressi tipicamente sia eccitatori e inibitori variano con proprietà di stimolo e, quindi, non è possibile valutare l'impatto esatto che cambiamenti in uno di questi ingressi ha sulla spiking neuronale.

Un approccio alternativo per aggirare queste limitazioni è quello di effettuare registrazioni morsetto dinamici, che consentono una valutazione critica del contributo dei singoli ingressi sinaptici a chiodare uscita. La tecnica di clamp dinamico consente l'iniezione diretta di corrente nella cella e la quantità di corrente iniettata in un dato tempo dipende dal potenziale di membrana rilevato all'epoca ^1,2,3 (per una rassegna, cfr ^7,14). È una pinza amperometrica modificato set-up in cui un'interazione feedback in tempo reale, rapida tra la cella sotto registrazione e l'apparecchiatura comprendente hardware specializzato, softwaree un computer è raggiunto. La quantità di corrente iniettata nella cellula viene calcolato di conseguenza. Quindi, il vantaggio di questo metodo è che la cellula può essere stimolato con diverse combinazioni di forme d'onda conduttanza, e la sua risposta sarà mimare l'attivazione di recettori che mediano ingressi sinaptici. Per esempio, il confronto della risposta alla iniezione di conduttanze eccitatori e inibitori per un piccolo punto con la risposta a iniezione di conduttanza eccitatoria per una piccola macchia fornisce solo informazioni sull'impatto di inibizione sulla risposta cellulare. Allo stesso modo, altre combinazioni di conduttanze fisiologicamente registrati possono essere co-iniettata per rivelare come i cambiamenti nella conduttanza eccitatorie e / o inibitorie stimolo-dipendente influisce uscita picco.

Nel nostro studio, la tecnica del clamp dinamico viene utilizzato per dimostrare l'impatto della ampiezza relativa e tempistica di input sinaptici sulle proprietà lancio di cellule gangliari retiniche. Vari conduttanzeottenuti da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di agenti farmacologici sono stati impiegati come ingressi. Inoltre, conduttanze artificiali basati su funzioni alfa sono stati utilizzati anche per studiare come ingressi sinaptici sono integrati dai neuroni. Così questa è una tecnica versatile che consente vari tipi di conduttanza generati in modo fisiologicamente, farmacologicamente o computazionalmente per essere iniettato nella stessa cellula gangliare, così confronto delle risposte a questi ingressi può essere fatto.

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Protocollo

1. Generale Set Up e Preparazione del tessuto

1. Mantenere il mouse al buio per 30 min (mirare a ridurre il suo livello di stress). Durante l'attesa, preparare 1 L di soluzione extracellulare. Prima sciogliere 1,9 g di bicarbonato di sodio in mezzo litro di acqua Milli-Q. Il suo pH è mantenuto a 7,4 facendo gorgogliare 95% O ₂ e 5% di CO _2. Cinque minuti dopo, sciogliere 8,8 g di Ames medio in 100 ml di acqua Milli-Q, aggiungere alla soluzione di bicarbonato di sodio, alto fino a 1 L con acqua Milli-Q e mescolare bene. Conservare questa soluzione carboxygenated per il resto dell'esperimento.
2. Prendete 250 ml di carboxygenated Ames Medium e impostare il sistema riperfusione fluido nel elettrofisiologico set-up. Mantenere la soluzione carboxygenated.
3. Uniformemente spalmare un sottile strato di grasso per vuoto sul fondo della camera di perfusione. Sigillare con un vetrino e assicurarsi che sia a tenuta d'aria. Prendete una piccola quantità di grasso (circa 2 mm di diametro) e posizionarlo sulla parte superiore eestremità inferiori della camera. Queste sfere terrà la griglia (telaio platino infilate con fili interdentali) in posizione e impedire che un'eccessiva pressione sulla retina. Fissare la camera sulla piattaforma e allineare entrambe le aperture.
4. L'animale è prima anestetizzati con isoflurano per 2 minuti, e poi sacrificati per dislocazione cervicale. Rimuovere rapidamente gli occhi con un paio di forbici piccole (pale), lavare accuratamente con carboxygenated liquido extracellulare in un piccolo bicchiere, e poi posto in una capsula di Petri riempita con carboxygenated liquido extracellulare.
5. Sotto il microscopio da dissezione, fare un foro di inserimento nella cornea (~ 2 mm dal bordo) utilizzando un ago calibro 19. Ripetere l'operazione per l'altro occhio. Questo importante passo dovrebbe essere veloce per consentire l'ossigenazione dei due retine. Rimuovere una cornea con un paio di piccole forbici iris tagliando parallelamente al suo bordo. Quindi, rimuovere l'iride e la lente con un paio di pinze sottili. Ripetere l'operazione per l'altro occhio. Trasferire una tazza occhio in un bicchiere contenentecarboxygenated soluzione extracellulare.
6. Con una lama da bisturi, tagliare una tazza occhio in mezzo, per essere in grado di appiattire il tutto il montaggio e per ottenere due tutto-monti per retina. Separare accuratamente la retina dalla epitelio pigmentato con una sonda dissezione smussato o tirandola delicatamente fuori. Una volta staccata, la retina è abbastanza trasparente. Notare la superficie convessa è il lato fotorecettori. La superficie concava è il lato cellule gangliari e potrebbe rimanere attaccata stesso a causa della presenza di appiccicoso vitreo.
7. Con un paio di pinze sottili, tenere il bordo della retina distaccata tessuto vicino alle serrata e afferrare i serrata con un altro paio di pinze fine, tirarlo verso il centro della retina. Questo è un processo delicato e può richiedere alcuni tentativi. In caso di successo, serrata, corpo ciliare e vitreo vengono rimossi da questo processo, e la curvatura della retina è ridotto (cioè più piatta).
8. Tagliare i bordi, e poi trasferirlo al percamera di fusione con cellule gangliari rivolti verso l'alto. Tenere il tessuto in posizione disponendo la griglia sulle punte grasso. Posizionare il tessuto rimanente con l'altro oculare per un uso successivo. Procedure simili per la dissezione della retina sono descritti in Middleton e Protti ¹⁶ e Pottek et al. ^17.
9. Montare la camera di registrazione sotto un microscopio verticale. Istituire immediatamente la perfusione continua della retina con soluzione extracellulare carboxygenated (35,5 ° C) ad una velocità di 3-5 ml / min. Assicurarsi che l'elettrodo di messa a terra è a posto.
10. Attaccato al microscopio è una fotocamera digitale che permette la visualizzazione del tessuto. L'intero set up siede sopra un tavolo dell'aria (assorbimento degli urti) e all'interno di una gabbia di Faraday (blocca i campi elettrici statici e non statici esterni).
11. Accendere la sorgente di luce (infrarossi,> 850 nm) e con un obiettivo 40X, portare la sua attenzione sui corpi cellulari delle cellule gangliari. Trovare l'area centrale di tutta-mount per regiding.
12. Sbrinamento una fiala congelata di K ⁺ soluzione basata intracellulare (300 pl, pH = 7,4) contenente (in mM) K-gluconato: 140, acido HEPES: 10, MgCl _2: 4.6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0.4 e EGTA: 10. Tutti i reagenti acquistati da Sigma-Aldrich.

2. Patching cellulari organismi cellule gangliari della retina

1. Primo fuoco lucidare le estremità del tubo di vetro borosilicato capillare, poi tirare con un microelettrodo Estrattore di vetro con due fasi di riscaldamento (resistenza: 5-8 MW).
2. Aggiungere 3 ml di Lucifer Yellow (concentrazione finale 0,2%) per la soluzione intracellulare, mescolare bene, e centrifugare. Successivamente, trasferire il top 85% della soluzione in una siringa da 1 ml, collegarlo a un micron unità ilter 0,22 f, quindi ad un G ago ipodermico 30 riutilizzabile. Mettete in frigorifero.
3. Fissare la pipetta di vetro, di analoghe dimensioni punta a quelli utilizzati per le registrazioni, nel suo supporto e spostarlo sotto il microscopio con un micromanipulator. Sotto un obiettivo 40X, abbassare lentamente la pipetta finché fa una piccola fossetta sulla superficie della membrana limitante interna. Avanzare con cautela la pipetta in avanti fino a quando non raggiunge una piccola quantità di tessuto, e quindi spostarlo verso l'alto e / o lateralmente a strappare un piccolo foro per esporre i corpi cellulari delle cellule gangliari. Più piccolo è il foro, maggiore è mantenuta l'integrità della rete retinica. Se lo si desidera, solforodamina 101 (SR101; 0,5-1 micron) possono essere aggiunti al mezzo extracellulare di etichettare i neuroni danneggiati utilizzando la microscopia a fluorescenza ^15.
4. Riempire una pipetta pulita con 8-10 ml di soluzione intracellulare. Inserire nel supporto attaccato al palco la testa del amplificatore e assicurarsi che l'elettrodo di cloruro di argento clorurato è sommerso. Scartare il vaccino se lo sporco e / o bolle d'aria è / sono presente.
5. Accendere tutte le apparecchiature. Abbiamo usato un EPC 8 cerotto amplificatore clamp controllato da PatchMaster per ottenere registrazioni cellule intere in tensione con morsettofigurazione. Si noti che altri amplificatori che permettono attuali registrazioni clamp in modalità veloce possono anche essere utilizzati. Applicare e mantenere la pressione positiva nella soluzione pipetta. Selezionare una cella con un corpo cellulare grande in modo più probabile è una cellula gangliare piuttosto che una cella amacrine spostata o una cellula gliale. Lentamente abbassare la punta della pipetta Così sta facendo una piccola fossetta sulla superficie della membrana, arrestare, e rilasciare la pressione. Abbassare immediatamente il potenziale di mantenimento a - 60 mV. Una volta che un gigaseal (GΩ) viene raggiunto tra loro, succhi lentamente a rompere la membrana per ottenere una configurazione patch clamp whole-cell. Questa procedura è un passo delicato, se viene applicata troppa pressione negativa, allora la connessione diventa permeabile; se troppo poco, la membrana rimane intatto.
6. Nel tempo, giallo Lucifero riempirà la cella, consentendo la visualizzazione della morfologia della cellula. Se stabile, questo set-up dovrebbe durare più o 30 min.

3. Le registrazioni delle cellule gangliari Uso Dynamic morsetto

1. Prima, un test corrente-tensione (da - 75 a + 35 mV ogni 10 mV) viene eseguita usando PatchMaster. Procedere alle prove successive solo se una grande corrente Na ⁺ (> 1 nA) è presente. Si noti che nella rara occasione in cui è patchato una cella amacrine sfollati, in quel caso, non risponderà con i treni di potenziali d'azione per le successive iniezioni di corrente.
2. Apri LabVIEW ed eseguire il programma personalizzato scritto Neuroakuma, quindi caricare varie forme d'onda di conduttanza. Impostare il numero di ripetizione a 8 (6-8 a fini statistici). Impostare potenzialità inversione di conduttanze eccitatori e inibitori a 0 e - 75 mV rispettivamente. Selezionare una coppia corrispondente di conduttanze eccitatori e inibitori per il test. Eccitatorio traccia conduttanza (in verde) e inibitori traccia conduttanza (in rosso) verranno visualizzati nel pannello inferiore.
3. Torna PatchMaster, selezionare la modalità morsetto corrente e passare immediatamente l'amplificatore in modalità morsetto corrente 'CC + Comm. VELOCE'. Questa modalità permette di accurately seguire i rapidi cambiamenti del potenziale di membrana. Se una buona tenuta tra la membrana e la pipetta è mantenuto, poca / nessuna compensazione è necessaria, altrimenti la registrazione non durerà a lungo. In Neuroakuma, premere il pulsante "record". La risposta cellulare (di solito con una raffica fasica dei potenziali d'azione, figura 1A) apparirà sul pannello superiore. Iniettare corrente nella cella con bassa scala di conduttanze prima, se poca / nessuna risposta si osserva, aumenterà in piccoli incrementi fino a produrre una risposta forte. Iniezione di corrente eccessivo può uccidere la cellula. Test, una volta completate, selezionare una nuova coppia di forme d'onda conduttanza, ripetere quanto sopra per tutte le coppie di conduttanze fisiologiche e artificiale. Le correnti fisiologiche (I) iniettati in tempo reale sono basate su:
   I (t) = G _exc (t) x (V _m (t) - V _exc) + G _inh (t) x (V _m (t) - V _inh)

Conduttanza (G in nS) potrebbe essere synaptic o artificiale. Eccitatori e inibitori della conduttanza sinaptica forme d'onda sono stati raccolti da precedenti esperimenti eseguiti da Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen e Salomone (risultati non pubblicati), in risposta a diversi stimoli visivi in ​​condizioni di controllo e in presenza di tetrodotossina (TTX, 1 micron) . Conduttanza Artificiale forme d'onda sono stati modellati utilizzando una funzione alfa. V _m (in mV) è il potenziale di membrana registrata. G e G _{exc inh} rappresentano conduttanze eccitatori e inibitori rispettivamente, mentre V _exc e V _ab rappresentano le potenzialità di inversione di conduttanze eccitatori e inibitori rispettivamente. Il tempo è t in ms. Frequenza di campionamento è 40 kHz.
I _s = I ₀ (t / α) ^{e-vostre rilassanti}

L'equazione di cui sopra è una funzione alfa (I ₀ = corrente massima; 1 / α = tempo di picco (sec ^-1) della corrente). Il tempo di salita e tempo di decadimento del sinapticacorrente è dettata dalla α ^4. La conduttanza eccitatorio era invariata mentre la latenza della conduttanza inibitorio è stato modificato, riducendo il ritardo rispetto alla comparsa di eccitazione (Figura 2D).

4. Dopo la registrazione, ritrarre accuratamente la pipetta in modo che il corpo cellulare rimane intatta. Fissa immediatamente il tessuto in paraformaldeide al 4% per 30 minuti, seguita da tre lavaggi 10 min con 0,1 M di tampone fosfato. Mettete in frigorifero ed eseguire anticorpo macchiare il giorno successivo o entro una settimana.

4. Anticorpo colorazione Contro Lucifero gialla pieno cellule gangliari della retina

1. Colorazione degli anticorpi contro il giallo cellule gangliari Lucifero riempito a temperatura ambiente (anti-IgG di coniglio Lucifero Giallo primario (diluizione = 1:10.000) per cinque giorni, il sesto giorno, la colorazione durante la notte con secondario di capra anti-IgG di coniglio (diluizione = 1:500 )). Bagnare montare la retina in fluorescenza media conservazione. Coprire scivolare e sigillare con chiodo polish.
2. Scattare foto confocale della morfologia delle cellule con un Leica Spec-II microscopio confocale (Figura 1B). La presenza di un assone permette la conferma delle cellule gangliari.

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Risultati

Il contributo delle diverse fonti di input inibitorio per le risposte delle cellule gangliari è dimostrata attraverso l'applicazione di varie forme d'onda conduttanza. Queste forme d'onda sono stati ottenuti con stimoli di diversa luminanza in condizioni normali e in presenza di TTX, una tensione-gated Na ⁺ bloccante dei canali che un'azione blocchi generazione potenziale solo in un sottoinsieme di inibitori interneuroni retinici. Figura 2A mostra una risposta rappresentativo...

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Discussione

Qui mostriamo l'uso di clamp dinamico per valutare l'influenza del rapporto e relativa tempistica di eccitazione e di inibizione sulle cellule gangliari retiniche uscita. Morsetto dinamica fa uso di simulazioni al computer per introdurre conduttanze sinaptiche fisiologicamente registrati o artificiale in neuroni viventi. Questa metodologia fornisce uno strumento interattivo con cui conduttanze possono essere modificati e iniettate in neuroni per calcolare la loro influenza sulle risposte neuronali. Conduttanza f...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation