יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Summary

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

Abstract

תאי הגנגליון הם תאי עצב הפלט של הרשתית ופעילותם משקפת את האינטגרציה של קלטים סינפטיים מרובים הנובעים ממעגלים עצביים ספציפיים. טכניקות תיקון מהדק, מהדק מתח ובתצורות מהדק הנוכחי, משמשות בדרך כלל כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של תאי עצב ולאפיין התשומות סינפטיים שלהם. למרות היישום של טכניקות אלה הוא אינפורמטיבי מאוד, הם מציבים מגבלות שונות. לדוגמה, קשה לכמת את האופן שבו האינטראקציות המדויקות של תשומות מעוררות ומעכבות לקבוע פלט תגובה. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בטכניקה שונה נוכחית מהדק, מהדק דינמי, המכונית גם מוליכות ^{1 מהדק, 2, 3} ובדקנו את ההשפעה של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות על רגישות עצבית. טכניקה זו דורשת הזרקה של זרם לתוך התא ותלוי במשוב בזמן אמת של פוטנציאל הקרום שלה באותו זמן. Injecteד הנוכחי מחושב מראש conductances מעוררים והמעכב, הפוטנציאלים סינפטיים היפוכם ואת הפוטנציאל המיידי הקרום של התא. פירוט השיטה הניסיוני, תיקון הידוק תאים כדי להשיג תצורה כל תא ותעסוקה של טכניקת המהדק הדינמית באות לידי ביטוי במאמר זה וידאו. כאן, אנו מציגים את התגובות של תאי הגנגליון ברשתית עכבר לצורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחותו של סמים. יתר על כן, אנו מציגים את השימוש בconductances מעוררים והמעכב המלאכותיים שנוצר באמצעות פונקציות אלפא לחקור את התגובות של התאים.

Introduction

הרשתית היא רקמה עצבית כמעט שקופה המצפה את החלק האחורי של העין. מחקרים רבים משתמשים ברשתית כמודל כדי לחקור את צעדיו הראשונים בעיבוד חזותי ומנגנונים של איתות הסינפטי. מאז רשת הרשתית בהכנה כל ההר נשארה שלמה לאחר נתיחה, הוא מייצג מערכת אידיאלית ללמוד אינטראקציות הסינפטי כתגובות הפיזיולוגיות שלו דומות מאוד לתנאים בvivo. כך, באמצעות רשתית מבודדת את המאפיינים של תאי העצב שלו ניתן ללמוד תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון (לביקורות על הטכניקה, ראה ^6,9,13). זיהוי התרומה של מעגלים ומוליכים עצביים לתגובת תא גנגליון הספציפיים המדויקת, לעומת זאת, בדרך כלל הפריע כסוכנים תרופתיים לפעול באתרים שונים.

תגובות פיסיולוגיות של תאי עצב ברשתית לאור, הגירוי הטבעי, ניתן להקליט עם pipettes זכוכית מלא בנוזל תוך תאי. באמצעות תיקון CLטכניקות מגבר, תגובות עצביות לגירוי אור ניתן להקליט כמו תנודות פוטנציאל הממברנה (מהדק נוכחי) או כזרמים (מהדק מתח). על ידי החזקת פוטנציאל הממברנה במתחים שונים וביישום ניתוח מוליכות בדיעבד, אפשר לבודד את תשומות סינפטיים מעכבות ומעוררות ^5,12. סוג זה של ניסויים יכול להתבצע במדיום רחצה רגיל ובנוכחותם של סוכנים תרופתיים שונים כדי לבודד את תרומתו של נוירוטרנסמיטורים ואת הקולטנים לתגובות עצביות שונים. שפע של מחקרים ממעבדות רבות אפיין את התלות של תפוקה ותשומות spiking מעוררות ומעכבות על נכסי תמריצים כגון גודל, בניגוד, תדרי מרחב ובזמן, כיוון, כוונה ומשתנים גירוי אחר. אם כי אלה גישות ניסיוניות לספק מידע על הקשר בין התפוקה ותשומות ספייק סינפטיים כפונקציה של מאפייני גירוי,הפרשנות של התרומה של סוגי תאים מסוימים והתשומות סינפטיים לרגישות תא היא לא פשוטה. זאת בשל העובדה שהן בדרך כלל תשומות מעוררות ומעכבות להשתנות עם מאפייני גירוי ולכן, לא ניתן להעריך את ההשפעה המדויקת ששינויים בכל אחד מתשומות אלה יש בspiking העצבי.

גישה חלופית כדי לעקוף מגבלות אלו היא לבצע הקלטות מהדק דינמיות, המאפשרות הערכה ביקורתית של התרומה של תשומות סינפטיים בודדות לspiking פלט. טכניקת המהדק הדינמית מאפשרת הזרקה ישירה של זרם לתוך התא ואת כמות המוזרקת נוכחי בזמן נתון תלויה בפוטנציאל הקרום נרשם באותה תקופה ^1,2,3 (לסקירה, ראה ^7,14). זוהי הגדרת מהדק נוכחי שונה שבו אינטראקציה משוב בזמן אמת, במהירות בין התא מתחת להקלטה והציוד הכולל חומרה מיוחדת, התוכנהומחשב מושגת. כמות המוזרקת הנוכחי לתוך התא מחושבת בהתאם. לפיכך, היתרון של שיטה זו הוא שהתא יכול להיות מגורה עם שילובים של צורות גל מוליכות שונות, והתגובה שלה תהיה לחקות את ההפעלה של קולטנים שמתווכים תשומות סינפטיים. לדוגמה, השוואה בין התגובה להזרקה של conductances המעוררות והמעכב לנקודה קטנה עם התגובה להזרקה של מוליכות הגירוי לנקודה קטנה מספקת מידע לגבי ההשפעה של עיכוב בתגובת תא בלבד. כמו כן, שילובים אחרים של conductances נרשם פיסיולוגיים יכולים להיות שותף הזריק לחשוף כיצד גירוי תלוי שינויים בconductances המעוררות ו / או מעכבות משפיעים על התפוקה בספייק.

במחקר שלנו, נעשתה שימוש בטכניקת המהדק הדינמית כדי להדגים את ההשפעה של המשרעת והעיתוי של תשומות סינפטיים על מאפייני הירי של תאי הגנגליון ברשתית היחסי. conductances השוניםהמתקבל מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחות של סוכנים תרופתיים הועסקו כתשומות. בנוסף, conductances מלאכותי המבוסס על פונקציות אלפא שמשו גם כדי לחקור כיצד תשומות סינפטיים משולבות על ידי תאי עצב. לכן זו היא טכניקה צדדי המאפשרת סוגים שונים של מוליכות נוצרו גם מבחינה פיזיולוגית, פרמקולוגית או המחשוב להיות מוזרקים לתוך אותו תא גנגליון, ולכן השוואה של תגובות לתשומות אלה יכול להתבצע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הגדרה כללית והכנת רקמה

1. שמור את העכבר בחושך במשך 30 דקות (במטרה להפחית את רמת המתח שלה). בזמן ההמתנה, להכין 1 ליטר של פתרון תאי. הראשון לפזר 1.9 גרם של סודה לשתייה בחץ ליטר המים מילי-Q. ה-pH שלו נשמר על ידי 7.4 מבעבעים עם 95% O ₂ ו 5% CO _2. חמש דקות לאחר מכן, לפזר 8.8 גרם של איימס בינוני ב100 מ"ל של מים מילי-Q, להוסיף לפתרון סודיום ביקרבונט, עליון עד 1 ליטר עם מים מילי-Q ומערבבים היטב. שמור פתרון זה carboxygenated לשארית של הניסוי.
2. קח 250 מ"ל של איימס בינוני carboxygenated ולהגדיר את המערכת בנוזל reperfusion אלקטרו ההגדרה. שמור את פתרון carboxygenated.
3. אחיד למרוח שכבה דקה של שומן ואקום על החלק התחתון של חדר זלוף. לאטום אותו עם פיסת כיסוי ולוודא שהוא אוויר חזק. קח כמות קטנה של שומן (~ 2 מ"מ קוטר) ולמקם אותו בחלק העליון ומסתיים תחתון של החדר. הכדורים האלה יחזיקו את הרשת (מסגרת פלטינה מתוחה עם חוט דנטלי) במקום ולמנוע אותה לחיצה חזקה מדי על הרשתית. תקן את התא על גבי פלטפורמה וליישר את שני הפתחים.
4. בעלי החיים הוא מורדמים ראשון עם Isoflurane למשך 2 דקות, ולאחר מכן הקריבו על ידי נקע בצוואר רחם. להסיר במהירות את העיניים עם זוג מספריים קטנים (להבים מעוגלים), לשטוף ביסודיות עם נוזל חוץ תאי carboxygenated בכוס קטנה, ולאחר מכן למקם בצלחת פטרי מלאה בנוזל חוץ תאי carboxygenated.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חור כניסה בקרנית (~ 2 מ"מ מהקצה) באמצעות מחט מד 19. חזור לעין השנייה. צעד חשוב זה צריך להיות מהיר כדי לאפשר חמצון של שניהם הרשתיות. הסר קרנית אחד עם מספריים קטנים קשתית על ידי חיתוך במקביל לקצה שלה. בשלב הבא, להסיר את הקשתית ועדשה עם זוג מלקחיים בסדר. חזור לעין השנייה. העבר את כוס עין אחת לתוך כוס המכילהcarboxygenated פתרון תאי.
6. עם להב סכין מנתחים, לחתוך כוס עין אחת לשתיים, כדי שתוכל לשטח את כל ההר, וכדי לקבל שני שלם mounts לרשתית. להפריד בזהירות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט באמצעות בדיקה לנתח בוטה או על ידי משייכתו בעדינות אותו. פעם אחת מנותק, הרשתית היא די שקופה. שימו לב למשטח הקמור הוא הצד הקולטני האור. המשטח הקעור הוא צד תאי גנגליון והוא עשוי להיצמד לעצמו בשל נוכחותם של הומור זגוגית דביק.
7. עם זוג מלקחיים בסדר, להחזיק את הקצה של רקמת הרשתית המנותקת הקרובה לserrata האורה ולתפוס את serrata האורה עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים, מושך אותו לכיוון מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין ועלולים לקחת כמה ניסיונות. אם יצליח, serrata אורה, גוף הריסים והומור זגוגית יוסרו על ידי תהליך זה, והעקמומיות של הרשתית מצטמצמת (כלומר להחמיא).
8. חתוך את הקצוות, ולאחר מכן להעביר אותו לכלקאמרי איחוי עם תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. החזק את הרקמות במקום על ידי הצבת הרשת על גבי כדורי הגריז. הנח את הרקמה שנותרה עם כוס העין השנייה לשימוש מאוחר יותר. נהלים דומים לנתיחת רשתית מתוארים במידלטון וProtti ¹⁶ וPottek et al. ^17.
9. הר חדר ההקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף. מייד הקים זלוף המתמשך של הרשתית עם פתרון carboxygenated תאי (35.5 מעלות צלזיוס) בשיעור של 3 - 5 מ"ל / דקה. ודא אלקטרודה ההארקה נמצאת במקום.
10. מצורף למיקרוסקופ הוא מצלמה דיגיטלית המאפשרת הדמיה של הרקמות. כל הסט עד יושב מעל שולחן אוויר (ספיגת זעזועים) ובתוך כלוב פאראדיי (שדות סטטיים ואינם סטטית חיצוניים בלוקים חשמליים).
11. הפעל את מקור האור (אינפרא אדום,> 850 ננומטר) ועם מטרת 40X, להביא את המיקוד שלה על גופי התא של תאי הגנגליון. מצא את האזור המרכזי של כל ההר לrecorדינג.
12. להפשיר בקבוקון קפוא של K ⁺ פתרון מבוסס תאי (300 μl, pH = 7.4) המכיל (מ"מ) K-גלוקונאט: 140, חומצת HEPES: 10, MgCl _2: 4.6, ה-ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0.4 וEGTA: 10. כל חומרים כימיים שנרכשו מסיגמה אולדריץ.

2. גופי תא תיקון של תאי הגנגליון ברשתית

1. אש ראשונה ללטש את הקצוות של צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט, ולאחר מכן למשוך אותם עם חולץ microelectrode זכוכית עם שני שלבי חימום (התנגדות: 5 - 8 MΩ).
2. הוסף 3 μl של צהוב לוציפר (ריכוז סופי של 0.2%) לפתרון תאי, ומערבב היטב, וצנטריפוגות זה. בשלב הבא, להעביר את 85% העליון של הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל, לחבר אותו ליחידת ilter F מיקרומטר 0.22, ולאחר מכן למחט מזרק לשימוש חוזר 30-G. שומר במקרר.
3. תקן את פיפטה הזכוכית, בגודל קצה דומה לאלה המשמשים להקלטות, במחזיק בו ולהעביר אותו תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulaטור. תחת מטרת 40X, לאט לאט להוריד את פיפטה עד שהוא עושה גומה קטנה על פני השטח של קרום הגבלה הפנימי. להתקדם בזהירות פיפטה קדימה עד שתופס כמות קטנה של רקמות, ולאחר מכן להעביר אותו כלפי מעלה ו / או לצדדים לקרוע חור קטן כדי לחשוף את גופי התא של תאי הגנגליון. קטן החור, גבוה יותר את מידת היושרה של רשת הרשתית נשמר. אם תרצה, sulforhodamine 101 (SR101; 0.5 - 1 מיקרומטר) ניתן להוסיף למדיום תאי לתייג תאי עצב שניזוקו על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ^15.
4. למלא את פיפטה נקיות עם 8 - 10 μl של פתרון תאי. הכנס אותו לבעל המצורף לבמה את ראשו של המגבר ולוודא את האלקטרודה כלוריד כסף כלור היא שקועה. בטל אם לכלוך ו / או בועות אוויר היא / הם הווה.
5. הפעל את כל הציוד. אנחנו השתמשנו מגבר מהדק תיקון 8 EPC הנשלט על ידי PatchMaster להשיג כל תא הקלטות בקון מהדק מתחפיגורציה. שימו לב שיכולים לשמש גם מגברים אחרים המאפשרים הקלטות מהדק הנוכחיות במצב במהירות. להחיל ולשמור על לחץ חיובי בפתרון פיפטה. בחר תא בגוף תא גדול כל כך סביר להניח שזה תא גנגליון במקום תא amacrine עקור או תא גליה. לאט לאט להוריד את קצה פיפטה כך שזה עושה גומה קטנה על פני השטח של הקרום, לעצור, ולשחרר את הלחץ. מייד להוריד את פוטנציאל ההחזקה ל-- 60 mV. ברגע שgigaseal (GΩ) מושגת ביניהם, בעדינות למצוץ לשבור את הקרום כדי להשיג תצורת מהדק תיקון כל תא. הליך זה הוא צעד עדין, אם לחץ שלילי יותר מדי מוחל, אז החיבור הופך דולף, אם מעט מדי, הקרום נשאר שלם.
6. במשך זמן, לוציפר צהוב ימלא את התא, ומאפשר הדמיה של המורפולוגיה של התא. אם יציב, הגדרה זו צריכה להימשך 30 דקות או יותר.

3. הקלטות של תאי הגנגליון שימוש Dynamiג קלאמפ

1. ראשית, בדיקה נוכחית במתח (מ - 75 עד 35 + mV כל 10 mV) מבוצע באמצעות PatchMaster. המשך לבדיקות מאוחרות יותר רק אם Na גדול ⁺ נוכחי (> 1 Na) הוא הווה. יצוין, כי באירוע הנדיר שבו תא amacrine העקורים הוא תוקנו, במקרה זה, לא יגיב עם רכבות של פוטנציאל פעולה לזריקות שוטפות לאחר מכן.
2. LabVIEW הפתוח ולבצע את תכנית Neuroakuma נכתב המותאמת אישית, ולאחר מכן לטעון את גל מוליכות שונים. להגדיר מספר חוזר עד 8 (6 - 8 למטרה סטטיסטית). הגדר פוטנציאלי היפוך של conductances המעוררות והמעכב וב0 - 75 mV בהתאמה. בחר זוג תואם אחד conductances המעוררות והמעכב לבדיקה. עקבות מוליכות מעוררות (בירוק) ועקבות מוליכות מעכבות (באדום) יופיעו בפנל התחתון.
3. חזור לPatchMaster, בחר מצב מהדק נוכחי, ולעבור באופן מיידי למצב מגבר המהדק הנוכחי "CC + תקשורת מהירה". מצב זה מאפשר לACCurately בצע שינויים מהירים בפוטנציאל הממברנה. אם איטום טוב בין הקרום ופיפטה נשמר, / אין צורך בפיצוי קטן, אחרת ההקלטה לא תימשך זמן רב. בNeuroakuma, לחץ על הכפתור "הרשומה". התגובה התאית (בדרך כלל עם פרץ phasic של פוטנציאל פעולה, איור 1 א) תופיע בפנל העליון. הזרק נוכחי לתוך התא עם דרוג נמוך של conductances הראשונה, אם מעט / אין תגובה הוא ציין, להגדיל במרווחים קטנים עד שהוא מייצר תגובה חזקה. הזרקה נוכחית מוגזמת יכולה להרוג את התא. בדיקות לאחר השלמה, בחר זוג חדש של צורות גל מוליכות, חזור מעל לכל הזוגות של conductances הפיזיולוגי והמלאכותית. הזרמים הפיסיולוגיים (אני) הוזרקו בזמן אמת המבוססים על:
   אני (לא) = G _exc (t) x (V _{מ '(t)} - V _exc) + G _INH (t) x (V _מ' (t) - V _INH)

מוליכות (G בNS) יכולה להיות סאיnaptic או מלאכותי. מניסויים קודמים שבוצעו על ידי Protti, די מרקו, הואנג, Vonhoff, נגויין וסולומון (תוצאות לא פורסמו) בתגובה לגירויים חזותיים שונים בתנאי בקרה ובנוכחות של צורות גל tetrodotoxin מוליכות הסינפטי מעוררות ומעכבות נאספו (TTX, 1 מיקרומטר) . גל מוליכות מלאכותי היה מודל באמצעות פונקצית אלפא. V _{מ '(בmV)} הוא פוטנציאל הממברנה המוקלט. G ו-G _{exc INH} מייצגים conductances המעוררות והמעכב בהתאמה תוך _exc V ו-V _INH מייצגים את פוטנציאלי ההיפוך של conductances המעוררות והמעכב, בהתאמה. זמן הוא לא בטרשת נפוצה. קצב דגימה הוא 40 קילוהרץ.
אני _S = אני ₀ (ט / α) ^{דואר αt}

המשוואה לעיל היא פונקצית אלפא (אני ₀ = זרם מרבי; 1 / α = זמן השיא (שניות ^-1) של נוכחי). זמן העלייה וזמן דעיכה של הסינפטינוכחי מוכתב על ידי α ^4. המוליכות מעוררות נותרות ללא שינוי בזמן ההשהיה של מוליכות מעכבות שונה, הפחתת העיכוב ביחס להתפרצות של עירור (איור 2 ד).

4. לאחר הקלטה, לחזור בו בזהירות פיפטה כך גוף התא נשאר ללא פגע. מייד לתקן רקמות בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות, ואחרי שלוש דקות עם 10 שוטף 0.1 מ 'של חיץ פוספט. מכניס למקרר ולבצע נוגדנים מכתימים את היום שלמחרת או בתוך שבוע.

4. מכתים נוגדן נגד תאי רשתית גנגליון וציפר צהובים מלאים

1. מכתים נוגדן נגד תאי וציפר צהובים מלא הגנגליון בטמפרטורת חדר (העיקרי נגד לוציפר ארנב IgG הצהוב (= דילול 1:10,000) לחמישה ימים; ביום השישי, מכתים הלילה עם שני עיזים נגד ארנב IgG (= דילול 1:500 )). הרטב לעלות רשתית במדיה שימור פלורסנט. כיסוי להחליק ולאטום עם המסמר עמ 'olish.
2. קח תמונות confocal של המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal Spec-השני לייקה (איור 1). נוכחותו של האקסון מאפשרת אישור לתאי גנגליון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרומתם של מקורות תשומות מעכבות לתגובות תא הגנגליון שונים באה לידי ביטוי באמצעות היישום של צורות גל מוליכות שונות. גל אלה התקבלו עם גירויים שונה של בהירות בתנאים רגילים ובנוכחותו של TTX, ⁺ חוסם מתח מגודרת Na ערוץ ש2A פעולת לוקי דור פוטנציאלי היחידה בקבוצת מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מציגים את השימוש במהדק דינמי כדי להעריך את ההשפעה של היחס והתזמון יחסי של עירור ועיכוב בתפוקת תא הגנגליון ברשתית. מהדק דינמי עושה שימוש בסימולציות מחשב כדי להציג את conductances סינפטיים פיזיולוגית מוקלט או מלאכותי לנוירונים חיים. מתודולוגיה זו מספקת כלי אינטראקט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation