Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Resumo

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Resumo

As células são os neurónios do gânglio da retina de saída e da sua actividade reflecte a integração de múltiplas entradas sinápticas neuronais decorrentes de circuitos específicos. Técnicas de patch clamp, na braçadeira de tensão e configurações de fixação atuais, são comumente usados ​​para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios e caracterizar suas entradas sinápticas. Embora a aplicação destas técnicas é altamente informativos, que representam várias limitações. Por exemplo, é difícil de quantificar a forma como as interacções precisas das entradas excitatórios e inibitórios determinar saída de resposta. Para resolver esse problema, usamos uma técnica de modificação actual braçadeira, braçadeira de dinâmica, também chamada de condutância braçadeira ^{1, 2, 3} e examinou o impacto dos insumos sinápticos excitatórios e inibitórios na excitabilidade neuronal. Esta técnica requer a injecção de corrente para dentro da célula e é dependente da realimentação em tempo real o seu potencial de membrana em que o tempo. O INJECTEd atual é calculado a partir predeterminados condutâncias sinápticos excitatórios e inibitórios, suas potencialidades e potencial reversão instantânea membrana da célula. Os detalhes sobre os procedimentos experimentais, as células de fixação adesivo para conseguir uma configuração de célula inteira e emprego da técnica de fixação dinâmico são ilustradas neste artigo de vídeo. Aqui, mostramos as respostas das células ganglionares da retina de rato a várias formas de onda de condutância obtidos a partir de experiências de controlo em condições fisiológicas, ou na presença de fármacos. Além disso, mostram o uso de condutâncias excitatórios e inibitórios artificiais gerados usando funções alfa para investigar as respostas das células.

Introdução

A retina é um tecido neural quase transparente que reveste a parte de trás do olho. Muitos estudos utilizam a retina como modelo para investigar os primeiros passos de processamento visual e os mecanismos de sinalização sinápticos. Uma vez que a rede de retina na preparação de toda a montagem permanece intacta após a dissecação,, representa um sistema ideal para estudar interacções sinápticas como as suas respostas fisiológicas são muito semelhantes à condições in vivo. Assim, usando uma retina isolado as propriedades de seus neurônios pode ser estudado usando técnicas de patch clamp (por comentários sobre a técnica, ver ^6,9,13). Identificação da contribuição exacta dos circuitos e de neurotransmissores na resposta a células ganglionares específicos, no entanto, é geralmente dificultado actuar como agentes farmacológicos em vários sites.

Respostas fisiológicas de neurônios da retina à luz, a estímulos naturais, podem ser gravados com pipetas de vidro preenchidos com fluido intracelular. Usando cl remendotécnicas ampères, respostas neuronais à estimulação de luz pode ser registrado como flutuações potenciais de membrana (pinça de corrente) ou como correntes (braçadeira de tensão). Ao manter o potencial de membrana a voltagens diferentes e execução de uma análise de condutância a posteriori, é possível isolar entradas sinápticos excitatórios e inibitórios ^5,12. Este tipo de experiências pode ser levada a cabo em meio de banho normal e na presença de diferentes agentes farmacológicos para isolar a contribuição de diferentes neurotransmissores e receptores para respostas neuronais. A riqueza de estudos de muitos laboratórios caracteriza a dependência da cravação de saída e entradas excitatórios e inibitórios em propriedades de estímulo, como o tamanho, o contraste, frequências espaciais e temporais, direção, orientação e outras variáveis ​​de estímulo. Embora essas abordagens experimentais fornecem informações sobre a relação entre a saída de pico e entradas sinápticas em função das propriedades de estímulo,interpretação da contribuição de tipos específicos de células e suas entradas sinápticas a excitabilidade das células não é simples. Isto é devido ao facto de as entradas geralmente estimulantes e inibidores variar com as propriedades de estímulo e, assim, não é possível avaliar com precisão o impacto que as alterações em qualquer destas entradas tem sobre spiking neuronal.

Uma abordagem alternativa para contornar essas limitações é realizar gravações braçadeira dinâmicos, que permitem uma avaliação crítica da contribuição de entradas sinápticas individuais para cravação de saída. A técnica de fixação dinâmica permite que a injecção directa de corrente para dentro da célula e a quantidade de corrente injectada num dado tempo depende do potencial da membrana registado naquele momento ^1,2,3 (para revisão, ver ^7,14). É uma pinça de corrente modificado set-up onde um tempo real, a interacção entre o retorno rápido de células sob o equipamento de gravação e que compreende hardware especializado, softwaree um computador é alcançado. A quantidade de corrente injectada para dentro da célula é calculado de acordo. Assim, a vantagem deste método é que a célula pode ser estimulada com diferentes combinações de formas de onda de condutância, e da sua resposta vai imitar a activação dos receptores que medeiam as entradas sinápticas. Por exemplo, a comparação da resposta à injecção de condutâncias excitatórios e inibitórios para um pequeno ponto com a resposta à injecção de condutância excitatória para uma pequena mancha apenas fornece informação sobre os efeitos da inibição da resposta celular. Da mesma forma, outras combinações de condutâncias fisiologicamente gravados podem ser co-injetado para revelar como as mudanças nas condutâncias excitatórios e / ou inibitórios estímulo-dependente afeta a saída de pico.

No nosso estudo, a técnica de fixação dinâmico é usado para demonstrar o impacto da amplitude relativa e de sincronização de entradas sinápticas nas propriedades de queima de células ganglionares da retina. Vários condutânciasobtidas a partir de experiências de controlo, em condições fisiológicas, ou na presença de agentes farmacológicos foram utilizados como entradas. Além disso, as condutâncias artificiais baseados em funções alfa também foram utilizados para investigar a forma como entradas sinápticas são integrados pelos neurónios. Assim, esta é uma técnica versátil, que permite que os vários tipos de condutância gerado ou fisiologicamente ou farmacologicamente computacionalmente para ser injectado na mesma célula ganglionar, para comparação de respostas a estas entradas podem ser feitas.

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Protocolo

1. Geral Configuração e Preparação Tissue

1. Mantenha o mouse na escuridão por 30 min (visam reduzir o seu nível de stress). Enquanto espera, se preparar uma solução de L extracelular. Primeiro dissolver 1,9 g de bicarbonato de sódio em meio litro de água Milli-Q. O seu pH é mantido a 7,4 por borbulhamento com 95% _de O2 e 5% de CO _2. Cinco minutos mais tarde, dissolver 8,8 g de Ames Médio em 100 ml de água Milli-Q, adicionar à solução de bicarbonato de sódio, superior até 1 I com água Milli-Q e misturar bem. Manter esta solução carboxygenated para o resto da experiência.
2. Tome 250 ml da carboxygenated Ames Médio e configurar o sistema de reperfusão líquido no eletrofisiológico set-up. Manter a solução carboxygenated.
3. Uniformemente esfregaço de uma fina camada de gordura de vácuo na parte inferior da câmara de perfusão. Selá-lo com uma lamínula e verifique se ele é hermético. Pegue uma pequena quantidade de graxa (~ 2 mm de diâmetro) e coloque-o na parte superior eextremidades inferiores da câmara. Estas bolas realizará a grade (armação de platina amarrados com fio dental) no lugar e impedi-lo pressionando muito difícil na retina. Fixe a câmara para a plataforma e alinhar as duas aberturas.
4. O animal é primeiro anestesiados com isoflurano durante 2 min, e depois sacrificados por deslocamento cervical. Remover rapidamente os olhos com um par de pequenas tesouras (lâminas curvas), lave com líquido extracelular carboxygenated em um pequeno recipiente e coloque em um prato de Petri cheia de líquido extracelular carboxygenated.
5. Sob um microscópio de dissecação, fazer um furo de inserção na córnea (~ 2 mm a partir da borda) utilizando uma agulha de calibre 19. Repetir para o outro olho. Este importante passo deve ser rápido para permitir a oxigenação da retina tanto. Remover uma córnea com um pequeno par de tesouras iris cortando paralelamente à sua borda. Em seguida, remova a íris e lente com um par de pinças finas. Repetir para o outro olho. Transferir um copo de olho em um copo contendocarboxygenated solução extracelular.
6. Com uma lâmina de bisturi, cortar um copo ocular para metade, para poder nivelar o conjunto de montagem e para obter duas montagens por inteiro retina. Separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar, utilizando uma sonda de dissecação sem corte ou puxando-a suavemente. Uma vez separado, a retina é bastante transparente. Observe a superfície convexa é o lado do fotorreceptores. A superfície côncava é de células do gânglio lateral e pode colar-se a si mesmo devido à presença de humor vítreo pegajoso.
7. Com um par de uma pinça fina, segure a borda do tecido isolada perto da retina a ora serrata e agarrar ora serrata com outro par de uma pinça fina, puxe-o para o centro da retina. Este é um processo delicado e pode demorar algumas tentativas. Se for bem sucedido, ora serrata, corpo ciliar e humor vítreo são removidas por este processo, e a curvatura da retina é reduzida (isto é, mais planas).
8. Apare as bordas e, em seguida, transferi-lo para o percâmara de fusão com as células ganglionares para cima. Segurar o tecido no seu lugar por colocação da grelha para as esferas de gordura. Colocar o tecido restante com a outra taça dos olhos para uso posterior. Procedimentos semelhantes para dissecção da retina são descritos em Middleton e Protti ¹⁶ e Pottek et al. ^17.
9. Monte a câmara de gravação sob um microscópio vertical. Configurar imediatamente a perfusão contínua da retina com uma solução extracelular carboxygenated (35,5 ° C) a uma taxa de 3-5 ml / min. Certifique-se o eletrodo de aterramento está no lugar.
10. Ligado ao microscópio é uma câmara digital, permitindo a visualização do tecido. O conjunto se senta por cima de uma mesa de ar (absorção de choque) e dentro de uma gaiola Faraday (blocos de campos elétricos estáticos e não-estáticos externos).
11. Ligue a fonte de luz (infravermelha,> 850 nm) e com uma objectiva de 40x, trazer o seu foco para os corpos celulares de células ganglionares. Encontre a área central do conjunto de montagem para recording.
12. Descongelar um frasco congelado de K ⁺ solução baseada intracelular (300 ul, pH = 7,4) contendo (em mM) de K-gluconato: 140, HEPES ácido: 10, MgCl _2: 4,6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0,4 e EGTA: 10. Todos os reagentes adquiridos da Sigma-Aldrich.

2. Corpos celulares patching de células ganglionares da retina

1. Primeiro fogo polir as extremidades dos tubos de vidro de borosilicato capilar, em seguida, retirá-los com um puxador de microeletrodos de vidro com duas etapas de aquecimento (resistência: 5-8 mohms).
2. Adiciona-se 3 ul de Amarelo Lúcifer (concentração final de 0,2%) para a solução intracelular, misturar bem e centrifugar. Ainda, a transferência da parte superior de 85% da solução numa seringa de 1 ml, ligá-lo a uma unidade mM ilter f 0,22, em seguida, para uma agulha hipodérmica L reutilizável 30. Leve à geladeira.
3. Fixe a pipeta de vidro, de tamanho semelhante ponta como aqueles usados ​​para as gravações, no seu suporte e movê-lo ao microscópio utilizando um micromanipulator. Abaixo de uma objectiva de 40x, diminuir lentamente a pipeta até que ela faça uma covinha na superfície da membrana limitante interna. Avançar cuidadosamente a pipeta para a frente até que ele apanha uma pequena quantidade de tecido, e em seguida movê-lo para cima e / ou lateralmente para rasgar de um pequeno orifício para expor os corpos celulares das células ganglionares. Quanto menor o furo, maior o grau de integridade da rede da retina é mantida. Se desejado, sulforrodamina 101 (SR101, 0,5-1 uM) podem ser adicionados ao meio extracelular para rotular os neurónios danificados por meio de microscopia de fluorescência ^15.
4. Encha uma pipeta limpa com 8-10 ml de solução intracelular. Inseri-lo no suporte ligado ao palco cabeça do amplificador e certifique-se o eletrodo de cloreto de prata clorada está submerso. Descartar se a sujeira e / ou bolhas de ar é / está presente.
5. Ligue todos os equipamentos. Usamos um EPC 8 remendo amplificador braçadeira controlado por PatchMaster para conseguir gravações de célula inteira em con braçadeira de tensãofiguração. Note-se que outros amplificadores que permitem gravações de aperto actuais no modo rápido também podem ser usados. Aplicar e manter uma pressão positiva na solução da pipeta. Seleccionar uma célula com um corpo da célula grande, então o mais provável é uma célula de um gânglio da célula em vez de amacrina deslocada ou uma célula da glia. Lentamente, abaixe a ponta da pipeta de modo a fazer-se uma pequena ondulação na superfície da membrana, parar e libertar a pressão. Reduzir imediatamente o potencial de realização de - 60 mV. Uma vez que um gigaseal (GÊ) é atingido entre eles, sugar delicadamente para romper a membrana para obter uma configuração de fixação de membranas de células inteiras. Este procedimento é um passo delicado, se demasiada pressão negativa é aplicada, em seguida, a ligação torna-se frágil, se for demasiado pequeno, a membrana continua intacta.
6. Ao longo do tempo, Lucifer Yellow vai encher a célula, permitindo a visualização da morfologia das células. Se estável, este set-up deve durar 30 minutos ou mais.

3. Gravações das células ganglionares Usando Dynamic braçadeira

1. Em primeiro lugar, a um teste de corrente e tensão (a partir de - 75 a + 35 mV cada 10 mV) é executado utilizando PatchMaster. Proceder a exames posteriores somente se uma grande corrente de Na ⁺ (> 1 nA) está presente. Observe que, em uma rara ocasião em que uma célula amacrine deslocados é remendado, nesse caso, não vai responder com trens de potenciais de ação para injeções atuais subseqüentes.
2. Abra o LabVIEW e executar o programa personalizado Neuroakuma escrito, em seguida, coloque a condutância várias formas de onda. Definir o número de repetição a 8 (6-8 para fins estatísticos). Definir potencial de reversão de condutâncias excitatórios e inibitórios em 0 e - 75 mV, respectivamente. Selecione um par correspondente de condutâncias excitatórios e inibitórios para o teste. Traço condutância excitatório (em verde) e trace condutância inibitória (em vermelho) aparecerá na parte inferior do painel.
3. Volte para PatchMaster, selecione o modo de fixação atual e mudar imediatamente o amplificador para o modo pinça de corrente 'CC + Comm FAST'. Este modo permite a accurately acompanhar as rápidas mudanças no potencial da membrana. Se uma boa vedação entre a membrana ea pipeta é mantida, pouco / não é necessária uma compensação, caso contrário, a gravação não vai durar muito. Em Neuroakuma, pressione o botão "record". A resposta celular (geralmente com uma explosão fásica de potenciais de acção, a Figura 1A) aparece no painel superior. Injectar corrente para dentro da célula com baixa escala de condutâncias em primeiro lugar, se pouca / nenhuma resposta é observada, aumentar em pequenos incrementos até que se produza uma resposta forte. Injecção de excesso de corrente pode matar a célula. Uma vez que os testes forem concluídos, selecione um novo par de condutância formas de onda, repita o procedimento acima para todos os pares de condutâncias fisiológicas e artificial. As correntes fisiológicas (I) injectados em tempo real são baseadas em:
   I (t) = L _exc (t) x (V _m (t) - V _iva) + L _inh (t) x (V _m (t) - V _INH)

Condutância (G IN NS) poderia ser synaptic ou artificial. Excitatórios e inibitórios condutância sináptica formas de onda foram coletados a partir de experiências anteriores realizadas por Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen e Salomão (resultados não publicados), em resposta a diferentes estímulos visuais em condições de controle e na presença de tetrodotoxina (TTX, um M) . Condutância onda artificial foram modelados usando uma função alfa. V _m (em mV) é o potencial da membrana registado. _Exc G e L _inh representar condutâncias excitatórios e inibitórios, respectivamente, enquanto _exc V e V _inh representam os potenciais de inversão de condutâncias excitatórios e inibitórios, respectivamente. Horário t em ms. Taxa de amostragem é de 40 kHz.
I I ₀ = _s (t / α) ^e-aT

A equação acima é uma função alfa (I ₀ = corrente máxima, 1 / α = tempo de pico (seg ^-1) de corrente). O tempo de subida e tempo de decaimento do sinápticaatual é ditada por α ^4. A condutância permaneceu inalterada, enquanto excitatório a latência da condutância inibitória foi modificado, reduzindo o seu atraso em relação ao início da excitação (Figura 2D).

4. Após a gravação, retirar cuidadosamente a pipeta de modo que o corpo da célula permanece intacta. Imediatamente fixar o tecido em paraformaldeído a 4% durante 30 minutos, seguido por três lavagens de 10 min com 0,1 M de tampão de fosfato. Refrigerar e realizar a coloração de anticorpos no dia seguinte, ou no prazo de uma semana.

4. Coloração de anticorpos contra Lúcifer amarelo enchido células ganglionares da retina

1. Coloração de anticorpos contra células ganglionares Lucifer Yellow cheias à temperatura ambiente (o anticorpo primário anti-IgG de coelho Amarelo Lúcifer (= diluição de 1:10.000) durante cinco dias, no sexto dia, a coloração durante a noite com secundário de cabra anti-IgG de coelho (diluição 1:500 = )). Molhe montar a retina em fluorescentes mídia Preservando. Cubra escorregar e selar com prego polish.
2. Tome imagens confocais da morfologia celular utilizando um Spec II microscópio confocal Leica (Figura 1B). A presença de um axónio permite a confirmação das células ganglionares.

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Resultados

A contribuição das diferentes fontes de entradas inibitórias para as respostas das células ganglionares é demonstrado através da aplicação de vários condutância formas de onda. Estas formas de onda foram obtidos com estímulos de luminância diferente, em condições normais e na presença de TTX, um bloqueador por voltagem canal de Na ⁺ que bloqueia acção potencial de geração de apenas um subconjunto dos interneurónios inibitórios da retina. Figura 2A mostra uma resposta repr...

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Discussão

Aqui demonstramos a utilização de uma pinça dinâmico para avaliar a influência da proporção e temporização relativa de excitação e de inibição sobre a produção de células ganglionares da retina. Braçadeira dinâmica faz uso de simulações de computador para introduzir condutâncias sinápticas fisiologicamente gravados ou artificial em neurônios vivos. Esta metodologia proporciona uma ferramenta interactiva através da qual pode ser modificado condutâncias e injectado neurónios para se calcular a su...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation