البروتوكولات الأمثل ل<em&gt; المتفطرة الجذامية</em&gt; إدارة الإجهاد: الأسهم المجمدة حفظ وصيانة في الفئران عارية Athymic

Summary

الجذامية المتفطرة، العامل المسبب للمرض الجذام، لا تنمو في المختبر. وصفنا وسيلة سهلة لمتابعة بروتوكول لإعداد تعليق العصوي لضمان الحفاظ على كميات كبيرة من M. الجذامية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. يتم وصف بروتوكولات لإكثار عن طريق الماوس قاطع الطريق التلقيح، وتقييم جدوى وتجميد والذوبان الأسهم العصوي بالتفصيل.

Abstract

الجذام، والناجمة عن المتفطرة الجذامية، هو أحد الأمراض المعدية الهامة التي لا تزال متوطنة في العديد من البلدان في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك البرازيل. لا يوجد حاليا أي طرق معروفة لزراعة M. الجذامية في المختبر، وتقديم عقبة رئيسية في دراسة هذا الممرض في المختبر. وبالتالي، فإن صيانة ونمو M. يتم تنفيذ سلالات الجذامية ويفضل في athymic الفئران عارية (NU-Foxn1 ^نو). هي ظروف المختبر لاستخدام الفئران متاحة بسهولة، وسهلة لتنفيذ، والسماح توحيد ووضع بروتوكولات لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول بسيط لتنقية العصيات من قطاع الطرق الماوس عارية باستخدام التربسين والتي ينتج عنها وقف مع الحد الأدنى من حطام خلية ومع ارتفاع مؤشر الجدوى البكتيرية، على النحو الذي يحدده المجهر الفلورسنت. وهناك تعديل لطريقة العد القياسية لالعصوي من قبل تسيل Neelsenتلطيخ ويتجلى أيضا المجهر الضوئي. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف بروتوكول للتجميد والذوبان الأسهم العصوي كبروتوكول بديلة لصيانة وتخزين M. سلالات الجذامية.

Introduction

الجذام، وهو مرض تسببه المتفطرة الجذامية، هو مشكلة صحية عامة مهمة في العديد من البلدان في جميع أنحاء العالم ^1،2. على الرغم من كونها تعرف باسم مرض معد يصيب الجلد والأعصاب الطرفية، لا تزال هناك العديد من الثغرات في المعرفة حول الآليات التي تشارك في إمراض مناعي معقدة من المرض.

من بين الخصائص تحديا M. الجذامية التي تعيق دراسته هي عدم قدرتها على النمو في وسائل الإعلام الاصطناعي الثقافة ومضاعفة الوقت الطويل نسبيا (حوالي 14 يوما) ^3،4. معظم الإجراءات التجريبية التي تستخدم M. يتم تعيين الجذامية مع عصيات تنقيته من الآفات الجلدية للمرضى الجذام أو من النماذج الحيوانية التجريبية، مثل المدرع وعدة سلالات من الفئران ^5،6.

لسنوات عديدة، ويتوقف الباحثون على تنقية M. الجذامية من الآفات الجلدية من lepr متعدد العصياتOSY المرضى لاستخدامها في الإجراءات التجريبية. عدة ظروف المختبر للزراعة في المختبر أو صيانة الحية M. وقد حاول الجذامية، ولكن حتى الآن، وقد أثبتت النماذج الحيوانية لتكون أكثر ملائمة لأغراض البحث. في 1960s و 1970s، بدأ الباحثون باستخدام الفئران والمدرع للكشف وتقييم M. الجذامية الجدوى، ورصد نمو البكتيريا في الاستجابة لمكافحة M. المخدرات الجذامية، وفي النمو والحفاظ على السلالات الفطرية ^2،4.

النماذج الحيوانية لديها بعض القيود، وخاصة في الرئيسيات غير البشرية والمدرع، بما في ذلك المخاوف الأخلاقية، وتكلفة الصيانة والبنية التحتية الخاصة اللازمة لصيانة الحيوان، والفقراء استنساخ النتائج والعوائد النهائية. حاليا، والفئران هي حيوانات النموذج المفضل للأبحاث الجذام. هي ظروف المختبر لاستخدام الفئران متاحة بسهولة، وسهلة لتنفيذ، وتسمح بروتوكولات موحدة ^{7،8،9. وقد استخدمت الفئران عارية في الحفاظ على م. الجذامية سلالات لأنه، حتى مع انخفاض الأحمال العصوي قابلة للحياة، وتي خلية الاستجابة المناعية نقص يؤدي إلى تشكيل الورم الحبيبي مندفعا والضرب العصوي جيدة. وبالتالي، اكتسب هذا النموذج الحيواني قبولا واسعا داخل الأوساط البحثية الجذام.}

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول بسيط لتنقية الأنزيمي من العصيات من قطاع الطرق الماوس عارية، وتهدف لإعداد M. الجذامية التعليق مع الحد الأدنى من حطام خلية ومع ارتفاع مؤشر الجدوى البكتيرية. يتم تحديد الجدوى بواسطة المجهر الفلورسنت، والتي يمكن أن يؤديها بسرعة في المختبر. نحن أيضا يبرهن على وجود تعديل على الطريقة القياسية للعد العصوي بسبب البرد تلوين تسيل Neelsen والمجهر الضوئي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بديل للصيانة وتخزين M. سلالات الجذامية، مما يسمح للتجميد والذوبان من شارع العصويocks.

Protocol

1. إعداد المتفطرة الجذامية تعليق

1. قبل القتل الرحيم الماوس عارية athymic (NU-Foxn1 ^نو)، وإعداد الحل التربسين وسائل الإعلام والثقافة (بروتوكول الكواشف - البروتوكولات 1 و 2 و 3). الموت ببطء الفئران عارية 4-5 أشهر بعد التلقيح مع م. الجذامية وفقا للمبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة ¹⁰ (تمت الموافقة على التجارب واستخدام الصور للحيوانات والتي تتم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان من Faculdade دي دي Odontologia باورو، USP). داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المستخدمة للتعامل مع الحيوانات، وتنظيف الماوس كامل مع الايثانول 70٪ كحول.
2. عقد مخلب الخلفية باستخدام ملقط مرقئ البعيدة لعظم الكعب مشتركة. قطع مخلب قبالة مع مقص تحت ملقط وتزج مخلب في 2٪ اليود لمدة 20 دقيقة. ثم، كرر الإجراء لمخلب الخلفية الأخرى.
3. نقل الكفوف لخزانة السلامة البيولوجية نظيفة لمزيد من العمل. اتخاذ الكفوف من اليود 2٪، وتجفيفها مع شاش معقم ثم جمع اثنين من قطاع الطرق باستخدام رقم 22 أو 23 مشرط شفرة، وإزالة جميع الأنسجة الرخوة (الأدمة، البشرة والأوتار والأعصاب) على مقربة من العظام. إزالة العظام الأمشاط والسلاميات و1 5. وضع المواد في طبق بتري معقمة وإزالة البشرة، عن طريق كشط تشغيله مع شفرة المشرط. قطع الأنسجة الى قطع صغيرة مع مقص ونقلها إلى أنبوب أسفل مستديرة. وزن الأنسجة وإضافة 1 مل من محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS). الحفاظ على أنبوب على الجليد لتجنب الاحماء من العينة.
4. إضافة 1 مل أخرى من HBSS والتجانس العينة باستخدام الخالط الأنسجة.
   1. أول دورة التجانس: 3 نبضات من 15 ثانية في سرعة 4 (14،450 دورة في الدقيقة).
   2. نقل طاف لالعقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، ويمر من خلال مصفاة الخلية للقضاء على الحطام المتبقي. يسمح الحل ليمر بها جراvity.
   3. إضافة 2 مل من HBSS إضافية، وتكرار دورة التجانس (القسم 1.4.1)، وتمرير العينات من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى.
   4. شطف مصفاة عن طريق إضافة HBSS لتبرزي حجم 9 مل. تجاهل مصفاة الخلية.
5. ذوبان الجليد قسامة من 0.5٪ محلول التربسين. إضافة 1 مل من التربسين إلى 9 مل من تعليق خلية للحصول على تركيز النهائي 0.05٪ التربسين. تجاهل المتبقية التربسين إذابة. احتضان لمدة 60 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. بعد الحضانة، وجعل حجم ما يصل الى 40 مل بإضافة ملحي معقم لتخفيف التربسين.
6. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
7. تجاهل طاف بواسطة قلب بعناية الأنبوب. resuspend الكرية من خلال الاستفادة من أنبوب ثم قم بإضافة 1 مل من محلول ملحي معقم. نقل تعليق إلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد قياس الحجم النهائي لتعليق (لحساب العائد / غرام من الأنسجة).
8. التجانس تعليق العصوي باستخدام 1 مل الأنسولين المحاقن مع إبرة 26 G في حين نقل تعليق لأنبوب جديد.
9. أداء الرقابة الميكروبيولوجية للتعليق عن طريق وضع قطرات 2 (50 شباط) من هو في كل وسيطة: 7H9 ووفينشتاين-جنسن المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 أيام، للكشف عن تلوث المتفطرات. وبالمثل، تطعيم الدماغ والقلب تسريب (BHI) المتوسطة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، للكشف عن تلوث البكتيريا الهوائية.
10. قسامة تعليق في أنابيب لتلطيخ: 35 ميكرولتر لالباردة تسيل Neelsen تلطيخ (بروتوكول 2)، و 200 ميكرولتر لتحديد الجدوى (بروتوكول 3).
11. بعد تسيل Neelsen تلطيخ (زد)، وحساب عدد عصيات حمض السريع / مل (AFB / مل). لالفئران عارية التلقيح، وإعداد 1 × 10 ⁸ AFB / مل التعليق، تأكد من أن لديك ما يكفي لتطعيم 30 حجم ميكرولتر / قاطع الطريق / الحيوانية (بروتوكول 5)، والحفاظ على التعليق الباردة حتى التلقيح. للتجميد، وإعداد 1 × 10 ⁷ AFB / مل سوسالتقاعد (البروتوكول 4).

2. الباردة تسيل Neelsen تلطيخ

1. قبل البدء في التلوين، وإعداد الحل المصل / الفينول والحلول زد تلطيخ (بروتوكول الكواشف - بروتوكولات 4 و 5). رسم ثلاث دوائر (الداخلية قطرها 10 ملم) على ثلاثة شرائح زجاجية باستخدام القلم المناعية. تحديد الشرائح: (1) العادية أو غير مخفف، (2) 01:10، و (3) 1:100 باستخدام قلم رصاص رقم 2 (ملاحظة: بعض الجرافيت يتلاشى قبالة بعد تلطيخ زد).
2. تمييع تعليق العصوي (الخطوة 1.10) إلى 1:10 و 1:100 التخفيفات التسلسلي، أي إضافة 5 ميكرولتر من تعليق غير مخفف و 45 ميكرولتر من المياه المالحة، ثم تأخذ 5 ميكرولتر من 1:10 و إضافة 45 ميكرولتر من المياه المالحة.
3. إضافة 5 ميكرولتر من الحل المصل / الفينول و 10 ميكرولتر من تعليق العصوي لكل دائرة. التجانس وموزعة بالتساوي في جميع أنحاء المنطقة من دائرة مع مقبض حلقة المتاح. انتظر تعليق لتجف على طاولة وتعادل.
4. بعد دrying، إصلاح مسحة بواسطة تمرير الشريحة 3 مرات على مدى اللهب الأزرق من الموقد بنسن (حوالي 20 مجموع ثانية) ^11.
5. لتلطيخ، وتغطي كامل سطح الشريحة مع تصفية تسيل Neelsen carbofuchsine (حوالي 5 مل) لمدة 20 دقيقة.
6. شطف الشرائح في الماء (تدفق بطيء) على التوالي.
7. تغطية الشريحة مع 10٪ محلول حمض الكحول لمدة 20 ثانية.
8. غسل الشريحة مرة أخرى في المياه الجارية.
9. تغطية الشريحة بمحلول أزرق الميثيلين لمدة 5 دقائق.
10. شطف الشريحة في المياه الجارية واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة.
11. عد 20 الحقول / دائرة (المجموع 60 الحقول / الشريحة) باستخدام الهدف الغمر النفط 100X. ويتم حساب حمض عصيات سريع / مل (AFB / مل) على النحو التالي، وفقا للوصف في مختبر تقنيات ^ل12 الجذام:
    AFB / حقل = العدد الإجمالي للعصيات وجدت في 3 دوائر (60 حقول) مقسوما على 60.
    AFB / مل = AFB / خ مجال ثابت (مساحة الدائرة× 100 مقسوما على مساحة فتحة عدسة الهدف)، وإذا عد تعليق الواحد، مضاعفة عدد AFB / مل من قبل عامل التخفيف (10 أو 100).

3. تحديد الجدوى

1. قبل البدء، وإعداد M. تعقيمها الجذامية تعليق (بروتوكول الكواشف - بروتوكول 7). استخدام عدة المناسبة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات) لتحديد النوعية لM. الجذامية الجدوى في التعليق. تمييع الحلول على النحو التالي (يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات تحت ضوء خافت): تمييع الحل وبمعامل 10 في المياه المالحة (1 ميكرولتر الأسهم بالإضافة إلى 9 المالحة ميكرولتر)، وتمييع الحل ب 20 بمعامل في المياه المالحة (1 ميكرولتر الأسهم بالإضافة إلى 19 ميكرولتر المالحة).
2. إضافة 3.6 ميكرولتر من المخفف حل A و 6 ميكرولتر من المخفف الحل B إلى 200 ميكرولتر من تعليق العصوي لفحصها (الخطوة 1.10). A M. تعقيمها سابقا يستخدم الجذامية التعليق بشكل روتيني باعتبارهاالسيطرة egative للبقاء تلطيخ.
3. احتضان الايقاف لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 10،600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
5. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 15 ميكرولتر من 10٪ الجلسرين. تطبيق 8 ميكرولتر على سطح شريحة زجاجية نظيفة وتغطية ذلك مع انزلاق الغطاء الصغيرة. تحليل الشريحة باستخدام المجهر الفلورسنت، والذي يحتوي على الفلاتر المناسبة (انظر التوصيات المسابر الجزيئية). تقييم النتائج من خلال مقارنة Syto 9 (سي) لتلطيخ يوديد propidium (PI) تلطيخ.
   ملاحظة: وصمة عار سي تخترق 100٪ من كل من البكتيريا الميتة وعلى قيد الحياة، وصمة عار PI تخترق البكتيريا فقط مع الأغشية التالفة. تعليق تعقيمها (المراقبة السلبية) قد تشكل كتل من البكتيريا بسبب وجود الحطام الخلوية. مقياس نصف كمي يستخدم لتقييم الحية / الميتة يختلف 0-2 +؛ 0 إلى أن أقل من 30٪ من الخلايا هي إيجابية للPI وصمة عار؛ 1 + يعني بين 30 -50٪ من الخلايا هي إيجابية للPI وصمة عار؛ 2 + يعني أكثر من 50٪ من الخلايا هي إيجابية للPI صمة عار. ويعتبر علامة من 0 أنسب للاستخدام.

4. تجميد / الذوبان M. الجذامية تعليق

1. قبل البدء، وإعداد المتوسطة تجميد (بروتوكول الكواشف - بروتوكول 6). للتجميد، استخدم الخطوات الموضحة أدناه:
   1. إضافة 150 ميكرولتر من تعليق تحتوي على 1 × 10 ⁷ AFB / مل إلى cryovial العقيمة مع 1 مل من تجميد المتوسطة.
   2. وضع cryovial في وعاء تجميد وتخزين الحاويات في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   3. نقل القارورة المجمدة إلى مربع التخزين وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. للذوبان، استخدم الخطوات الموضحة أدناه:
   1. إزالة cryovial مع تعليق المجمدة من -80 ° C ووضعه في حمام مائي 37 ° C لبدء ذوبان التعليق.
   2. صب التعليق في أنبوب تحتوي على 20 مل من العقيمةالمالحة. مزيج تعليق بلطف حتى الذوبان الكامل.
   3. الطرد المركزي تعليق لمدة 30 دقيقة، في 1،700 x ج، في 4 درجات مئوية.
   4. تجاهل طاف وإضافة ما يكفي من المياه المالحة عقيمة للوصول إلى حجم المطلوب. التجانس تعليق بتمريرها من خلال حقنة (الخطوة 1.8).
   5. زد للتلطيخ، وتحديد الجدوى والتلقيح، اتبع البروتوكولات 2 و 3 و 5.

5. الماوس التلقيح

1. وهناك حاجة إلى شخصين لهذا الإجراء، واحدة لكبح الماوس وآخر لإدارة اللقاح. وينبغي التعامل مع الحيوان ليتم تلقيح فقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الأخلاقية ويجب الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. كبح الماوس عارية من القفا من الرقبة مع الكفوف مواجهة.
2. التجانس تعليق بتمريرها من خلال 26 G الإبرة. مع حقنة 1 مل، نضح بما فيه الكفاية لوقف العصوي قائحالشركة المصرية للاتصالات اثنين من قطاع الطرق (30 ميكرولتر / قاطع الطريق).
3. عقد مخلب الخلفية، وتنظيف قاطع الطريق مع الايثانول 70٪ الكحول قبل الحقن وإدخال intradermally إبرة مع شطبة من الإبرة وأشار إلى الأعلى، من الأقرب إلى الجانب البعيد من قاطع الطريق. ضخ 30 ميكرولتر من التعليق. قد يتم تنفيذ الحقن قاطع الطريق في الفئران تخدير.
4. الانتظار 5 ثانية قبل سحب الإبرة من الجلد لتجنب ارتداد من اللقاح. وينبغي أن يضم الفئران على آخر ينة الفراش التلقيح، وينبغي رصد التمشي وعلامات تشويه الذات.

النتائج

نجاح البروتوكول يمكن تقييمها من خلال ثلاث طرق. أولا، يتم تحديد تقييم نوعية اللقاح بمقدار الحطام الخلوي ونسبة الناتج عن عصيات قادرة على البقاء في التعليق النهائية (انظر البروتوكول 3). كما هو موضح في الشكلين 1 و 2، تضمن التعليق العصوي النهائي القليل جدا من حطام خلية والجدوى العالية (النتيجة 0 +)، علما أن معظم عصيات ملطخة وصمة عار الفلورية الخضراء Syto 9 (وصمة عار تخترق 100٪ من كل من البكتيريا الميتة وعلى قيد الحياة، الشكل 1) وفقط عدد قليل من عصيات ملطخة وصمة عار الفلورسنت PI الحمراء (وصمة عار تخترق البكتيريا فقط مع الأغشية التالفة، الشكل 2).

الشكل 1. Syto 9 تلطيخ يوضح M. الجذامية التعليق. مضان أخضر وجود حيا وميتا M. الجذامية. 400X.

الشكل 2. PI تلطيخ M. الجذامية التعليق. الأحمر مضان يظهر عدد قليل من القتلى M. الجذامية. 400X.

الثانية، سيقوم اللقاح مع قابلية عالية تؤثر على تكاثر العصيات في قطاع الطرق من الحيوانات بعد 4-5 أشهر بعد التلقيح، مع تطور الآفة العيانية واضحة، كما هو موضح في الفيديو (بروتوكول 1). الطريق الثالث لتقييم نجاح البروتوكول هو من خلال تقييم بقاء وتكاثر AFB في قطاع الطرق الماوس تلقيح مع العصيات التي تم تجميدها لفترات مختلفة (انظر البروتوكول 4).

"هوامش الخلية =" 0 "> التجربة (الحيوان) عدد AFB / مل المجمدة في اليوم 0 النتيجة بقاء / يوم 0 فترة التجميد (أيام) عدد AFB تلقيح بعد تجميد النتيجة بقاء بعد تجميد عدد AFB / مل تعافى بعد 7 أشهر 1 (1) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 60 1.7 × 10 ⁵ 1 + 2.3 × 10 ⁸ 1 (2) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 60 1.7 × 10 ⁵ 1 + 3.8 × 10 ⁷ 1 (3) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 60 1.7 × 10 ⁵ 1 + 8.5 × 10 ⁷ 1 (4) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 60 1.7 × 10 ⁵ <الدفتيريا> 1 + 4.6 × 10 ⁷ 2 (1) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 4.2 × 10 ⁵ 1 + 1.7 × 10 ⁷ 2 (2) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 4.2 × 10 ⁵ 1 + 4.8 × 10 ⁶ 2 (3) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 4.2 × 10 ⁵ 1 + 8.6 × 10 ⁶ 3 (1) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 1.7 × 10 ⁵ 1 + 1.2 × 10 ⁷ 3 (2) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 1.7 × 10 ⁵ 1 + 1.8 × 10 ⁷ 3 (3) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 1.7 × 10 ⁵ 1 + 1.8 × 10 ⁷ 3 (4) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 1.7 × 10 ⁵ 1 + 2.6 × 10 ⁷ 3 (5) 1.0 × 10 ⁷ 0 + 15 1.7 × 10 ⁵ 1 + 3.7 × 10 ⁶

الجدول 1. نتائج M. الجذامية الضرب باستخدام الإيقاف آخر التجمد.

يصور الجدول 1 نتائج M. النمو الجذامية باستخدام الإيقاف بعد التجميد. كانت النتيجة بقاء الايقاف بعد ذوبان 1 +. تم تنفيذ بروتوكول تجميد في ثلاث تجارب مستقلة لاختبار فترات تجميد مختلفة. في كل التجارب مع قائح جمدت لمدة 15 أو 60 يوما، وكانت النتيجة مماثلة، صropagation بعد تجميد أسفرت عن زيادة 10-1،000 مرات في عدد من AFB تعافى من كل قاطع الطريق بعد 7 أشهر من التلقيح (الجدول 1). وبالتالي، فإن تجميد M. أدى تعليق الجذامية في 7H9 المتوسطة تستكمل مع OADC (حمض الأوليك الألبومين-سكر العنب، الكاتلاز) في الحفاظ على قدرتها على البقاء.

واستخدمت ثلاثة قائح لتقييم M. الجذامية الضرب بعد فترتين تجميد مختلفة (15 و 60 يوما). بعد 7 أشهر، تم انتشال العصيات من قطاع الطرق من الفئران الملقحة وعدها بعد تسيل Neelsen تلطيخ. نصف كمي على نطاق والجدوى: 0 سائل غياب تصل إلى 30٪ من الخلايا PI الملون؛ 1 + يعني بين 30-50٪ من الخلايا PI الملون، 2 + يعني فوق 50٪ من الخلايا PI الملون. AFB: عصيات حمض السريع.

Discussion

وصفا مفصلا ليتضح جيدا، بروتوكول ناجحة لنشر M. هناك حاجة ماسة الجذامية. يوضح دراستنا أن البروتوكول إعداد اللقاح عن طريق الترشيح والتربسين الهضم يسمح للقائح التي يمكن الحصول عليها مع القليل جدا من الحطام الخلوي ومع قابلية عالية من العصيات (النتيجة 0 +). وقد استخدم هيدروكسيد الصوديوم إلى تفصيل الأنسجة لتنقية عصيات ^6. الدراسات التي أجريت في مختبرنا باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لتنقية M. أدى الجذامية في تشكيل كتل من العصيات، مما يعوق تجانس تعليق لتحديد الجدوى والتلقيح الحيواني (لا تظهر البيانات).

واجه المشاكل المحتملة مع إعداد اللقاح عن طريق الترشيح والتربسين الهضم تتضمن كمية كبيرة من الحطام الخلوي وتلوث اللقاح مع وكلاء البكتيرية أو الفطرية. في حالة كميات كبيرة من الانقاض الخلويةويلاحظ بعد تنقيتها، إما التربسين لم تعد نشطة أو أن هناك كمية زائدة من المواد البيولوجية. يجب أن يتم تقييم النشاط الأنزيمي من محلول المخزون التربسين. إذا اشتبه كمية زائدة من المواد البيولوجية الأولية، ينبغي تقسيم المواد إلى مأخوذة وينبغي أن يتم على البروتوكول في دفعات منفصلة. لتجنب تلوث اللقاح مع وكلاء البكتيرية أو الفطرية، ويجب الحرص على معالجة المواد تحت ظروف معقمة. إذا تم الكشف عن فطرية و / أو التلوث الجرثومي يجب التخلص من التعليق.

وجود قيود على بروتوكول لدينا هو ذاتية تقييم الجدوى باستخدام طريقة شبه الكمي وصفها. تقييم الجدوى شبه كميا هو أكثر عملية، وإن كانت أقل دقة من الأسلوب الكمي نشرت ^6. النتيجة بقاء 0 + 1 + ومرضية لصيانة الانتشار وتجميدM. الجذامية. اهيري وآخرون. وقد أظهرت بالفعل أن الفئران عارية تلقيح مع 80-90٪ اللقاح قابلة للحياة، ينتج في قطاع الطرق مناسبة للحصاد (قابلية عالية العصيات) في 4-5 أشهر من التلقيح. وبالتالي، والعدوى في وقت مبكر (حوالي 4 أشهر) هو أفضل وقت الحصاد. لحصاد قائح المجمدة، والحفاظ على الفئران في هذا البروتوكول تلقيح لفترات أطول (7 أشهر) لضمان منحنيات النمو. خطوة حاسمة لضمان سلامة كافية هو استخدام معلقات عصيات الطازجة، ويفضل في غضون 24 ساعة بعد جمع المواد البيولوجية من المضيف وتجهيزها. وعلاوة على ذلك، ونوعية الكواشف، الطازجة التربسين وجدوى الحلول المخففة تلطيخ والتي تكون ضرورية لضمان النتائج استنساخه.

قيود أخرى من هذا البروتوكول هو أن M. النهائي الجذامية تعليق لا يخلو من الحمض النووي المضيف، RNA والبروتين وغيرها. لذلك، يجب إضافة خطوات أخرى لتنقية رس الحصول على M. الجذامية التعليق خالية من مكونات الخلية المضيفة.

وهناك طريقة للحفاظ على عصيات قادرة على البقاء من خلال تجميد عينات الأنسجة كاملة من م. وقد تم الإبلاغ عن الآفات الجذامية ^9. ومع ذلك، فإن الدراسة التي Portaels وآخرون. أظهرت خسائر كبيرة في قدرتها على البقاء، تتراوح ما بين 65-97٪ بعد تجميد والذوبان من M. إصابة الجذامية عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها من المدرع ^9. تظاهر بروتوكول لدينا أن مؤشر الجدوى لوحظ في M. انخفض تعليق الجذامية بعد تجميد والذوبان بالمقارنة مع قسامة التي لم يتم تجميد (الجدول 1). في الواقع، تجميد M. الجذامية التعليق في وسائل الإعلام تجميد أسفرت عن الجدوى تتراوح بين 50-70٪، مع بقاء النتيجة 1 +، في حين تم الحصول على صلاحية النتيجة 0 + في رفع التجميد التعليق. ومع ذلك، فإن تكاثر M. كان الجذامية مرضية بعد 7 أشهر بعد تلقيح الفئران عارية ( الجدول 1). في تلقيح الفئران عارية مع العينات المعاد الحفاظ المجمدة لمدة 60 يوما أدى إلى زيادة متوسط ​​100 مرة في عدد عصيات بالمقارنة مع اللقاح الأولي. يبدو أن تجميد M. الجذامية التعليق في وسائل الإعلام تجميد، بدلا من عينات الأنسجة المصابة، هو أكثر كفاءة. خطوة حاسمة لبروتوكول لدينا هو تجميد البطيء للAFB في وعاء التجميد واللازمة للحفاظ على عصيات قادرة على البقاء، كما يتبين من كولستون وهيلسون ^8. وستجرى التجارب في المستقبل لتقييم جدوى عصيات بعد فترات تجميد لفترة أطول.

باختصار، لأن M. الجذامية لا تنمو في المختبر، لدينا بروتوكول يسمح للبديل سريع وسهل لصيانة اللقاح قابلة للحياة، وخطوة ناجحة تجميد يجعل من الممكن الحفاظ على سلالات دون مرور مستمرة في الحيوانات، وبالتالي تمكين إنشاء بنك للسلالات محددة.

يحتوي هذا القسم على إرشادات لإعداد الكواشف لتنفيذ هذا البروتوكول.

1. التربسين

التربسين	0.5 ز
الماء المقطر	تصل إلى 100 مل

فلتر تعقيم. المحل في -20 درجة مئوية.

2. 7H9

7H9 قاعدة مرق	4.7 ز
40٪ الأسهم الجلسرين	5 مل
الماء المقطر	تصل إلى 900 مل

مزيج قاعدة مع الماء ثم يضاف الجلسرين مع التحريك. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعقيم. تخزين عند 4 درجات مئوية.

3. الدماغ القلب ضخ (BHI)

بهي	37 ز
الماء المقطر	ما يصل إلى 1،000 مل

الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعقيم. تخزين عند 4 درجات مئوية.

4. مصل الفينول

4.1) 5٪ فينول

الفينول	5 مل
الماء المقطر	تصل إلى 100 مل

4.2) الفينول المصل

مصل بقري جنيني	2 مل
5٪ فينول	98 مل

تخزين عند 4 درجات مئوية.

5. حلول لالباردة تسيل Neelsen وصمة عار

5.1) CarboFuchsin

فوكسين	1 ز
بلورات الفينول تنصهر إلى 60 درجة مئوية	5 مل
الكحول الإيثيلي النقي	10 مل
الماء المقطر	تصل إلى 100 مل

تصفية قبل كل استعمال.

5.2) الميثيلين الأزرق قاعدة

الميثيلين الأزرق	3 ز
95٪ الكحول الإيثيلي	ما يصل الى 200 مل

5.3) حمض الكحول

70٪ كحول	990 مل
حمض chloridric	10 مل

6. متوسطة للتجميد:

OADC	10 مل
الغليسيرول	20 مل
7H9 المتوسطة	تصل إلى 100 مل

الأوتوكلاف الجلسرين قبل الاستخدام وتعقيم OADC عن طريق الترشيح.

7. تعقيمها M. الجذامية تعليق

الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. المحل في -20 درجة مئوية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079